Ni Seplife  HP（NTA）是藍(lán)曉科技自主研發(fā)的一種新型親和層析介質(zhì)，是將氨基三乙酸基鍵合在高流速瓊脂糖凝膠過濾層析介質(zhì)上，再螯合金屬離子Ni2+形成的一種親和層析介質(zhì)，其利用樣品組分中的組氨酸與金屬離子的親和吸附進(jìn)行分離純化。Ni Seplife  HP（NTA）特異性好，螯合金屬離子更穩(wěn)定不易脫落，能耐受更高的還原劑，物理和化學(xué)性能穩(wěn)定，批次重復(fù)性好，顆粒粒度均勻，分離效果好，分辨率高。可用于分離純化能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及帶His 標(biāo)簽的重組蛋白。

使用方法

3.1 裝柱

裝柱按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。必須保證每種材料都處于工作溫度，凝膠裝柱前需要脫氣。

3.2平衡

用2~5個柱床體積的初始緩沖溶液進(jìn)行平衡，直至電導(dǎo)率、pH值等參數(shù)不變。

3.3上樣

（1）樣品一般溶解于pH6～8的初始緩沖液中，提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。

（2）緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，同時最好避免巰基乙醇、DTT等還原劑。

（3）常用緩沖液有10～100mmol/L磷酸鈉緩沖液、20～200mmol/LTris-HCl緩沖液等。

（4）緩沖液中一般要加入0.15～0.5mol/L的NaCl以消除離子交換作用。

（5）初次使用鎳螯合瓊脂糖凝膠時，推薦使用50mmol/L PBS（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4）作為初始緩沖液。

3.4洗脫

洗脫一般分為以下幾種方法：

（1）降低pH洗脫：大多數(shù)蛋白在pH 6～4會被洗脫下來（也可以在pH 3～4），緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。

（2）競爭性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質(zhì)的濃度（如0～0.5mol/L咪唑、0～50 mmol/L組氨酸、0～2mol/L NH4Cl）。

（3）螯合劑洗脫：EDTA、EGTA 等螯合劑可同金屬離子產(chǎn)生作用力會使蛋白被洗脫下來。但是此法不能分離不同的蛋白，會影響蛋白的吸附，導(dǎo)致融合蛋白無法掛柱。

備注：（1）初次使用時，如不確定洗脫需要的咪唑濃度，推薦在初始緩沖液中分別加入10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L咪唑，濃度從低到高分別洗脫和收集重組蛋白，之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。

（2）咪唑為堿性，相應(yīng)緩沖液配制后需要用HCl調(diào)節(jié)pH值。

（3）降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使金屬離子脫落，下次使用前需重新螯和金屬離子。

（4）有條件的可以進(jìn)行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。

上述洗脫方法，均須在緩沖液中加入150～500mmol/L的NaCl以消除離子交換作用。

3.5 再生

（1）多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時，必須將凝膠脫鎳再生。脫鎳方法：首先用5～10個柱床體積的蒸餾水淋洗柱子，然后用5～10個柱床體積的100mmol/L EDTA淋洗柱子，最后用2～3個柱床體積的0.5mol/L NaCl洗掉殘留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脫鎳后一般需要清洗。清洗方法：用0.1～1.0 mol/L NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1～2 h，不僅可以去除結(jié)合強的雜質(zhì)，也可以去除熱源。

（3）清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法：首先用2～5個柱床體積的蒸餾水充分平衡脫鎳后的柱子，然后用0.1～0.3mol/L金屬鹽溶液過柱5～10個柱床體積以螯合金屬離子，最后用5～10個柱床體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。

3.6在位清洗

（1）去除因離子交換作用吸附的蛋白：用2mol/L NaCl溶液反向清洗2～3個柱床體積。

（2）去除強疏水性蛋白和脂質(zhì)等：用70%乙醇或者30%異丙醇反向清洗4個柱床體積。

（3）除去沉淀蛋白、疏水性蛋白：參照凝膠再生步驟。

3.7存儲

密封保存在4~30℃（保存溶液為20%乙醇）干燥、通風(fēng)、清潔處，不可冷凍；用過的柱子保存在4~8℃，20%乙醇溶液中。

3.8運輸

運輸中避免日曬、雨淋、重壓，嚴(yán)禁與有毒、有害物品混運。

注意事項

（1）樣品與Ni Seplife  HP（NTA）必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進(jìn)行柱層析。 

（2）所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應(yīng)重裝。

（3）使用時保證柱子和緩沖液的溫度一致，避免柱床內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響純化效果。

（4）洗脫過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速，且勿過快。

（5）加樣及整個洗脫過程中，嚴(yán)防柱面變干。

生產(chǎn)日期：見標(biāo)簽

使用期限：在適當(dāng)?shù)馁A藏條件下可貯藏5年

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