Ni Seplife FF(NTA)是藍曉科技自主研發(fā)的一種新型親和層析介質,是將氨基三乙酸基鍵合在高流速瓊脂糖凝膠過濾層析介質上,再螯合金屬離子Ni2+形成的一種親和層析介質,其利用樣品組分中的組氨酸與金屬離子的親和吸附進行分離純化。鎳螯合高流速瓊脂糖層析介質(NTA)特異性好,流速快,螯合金屬離子更穩(wěn)定不易脫落,能耐受更高的還原劑,物理和化學性能穩(wěn)定,批次重復性好,顆粒粒度均勻,分離效果好??捎糜诜蛛x純化能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及帶His 標簽的重組蛋白。
產品牌號 | Ni Seplife FF(NTA) |
外觀 | 球狀凝膠,無臭無味 |
基質 | Seplife 6FF |
形狀 | 球形 |
最高流速(cm/h) | ≧370 |
耐壓(MPa) | 0.3 |
粒徑(μm) | 45~165 |
離子結合量 | (Ni2+ umol/ml):~20 |
pH穩(wěn)定性 | 3~13(長期);2~14(短期,在位清洗[CIP]) |
化學穩(wěn)定性 | 在常用水相溶液中穩(wěn)定:0.1M氫氧化鈉;0.01M鹽酸;8M尿素,70%醋酸,30%異丙醇 |
應用 | 適用His 標簽的重組蛋白純化 |
使用方法
3.1 裝柱
裝柱按照標準操作規(guī)程操作。必須保證每種材料都處于工作溫度,凝膠裝柱前需要脫氣。
3.2平衡
用2~5個柱床體積的初始緩沖溶液進行平衡,直至電導率、pH值等參數不變。
3.3上樣
(1)樣品一般溶解于pH6~8的初始緩沖液中,提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。
(2)緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽,同時最好避免巰基乙醇、DTT等還原劑。
(3)常用緩沖液有10~100mmol/L磷酸鈉緩沖液、20~200mmol/LTris-HCl緩沖液等。
(4)緩沖液中一般要加入0.15~0.5mol/L的NaCl以消除離子交換作用。
(5)初次使用鎳螯合瓊脂糖凝膠時,推薦使用50mmol/L PBS(50 mmol/L NaH2PO4,0.5 mol/L NaCl,pH 7.4)作為初始緩沖液。
3.4洗脫
洗脫一般分為以下幾種方法:
(1)降低pH洗脫:大多數蛋白在pH 6~4會被洗脫下來(也可以在pH 3~4),緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。
(2)競爭性洗脫:線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質的濃度(如0~0.5mol/L咪唑、0~50 mmol/L組氨酸、0~2mol/L NH4Cl)。
(3)螯合劑洗脫:EDTA、EGTA 等螯合劑可同金屬離子產生作用力會使蛋白被洗脫下來。但是此法不能分離不同的蛋白,會影響蛋白的吸附,導致融合蛋白無法掛柱。
備注:(1)初次使用時,如不確定洗脫需要的咪唑濃度,推薦在初始緩沖液中分別加入10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L咪唑,濃度從低到高分別洗脫和收集重組蛋白,之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。
(2)咪唑為堿性,相應緩沖液配制后需要用HCl調節(jié)pH值。
(3)降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使金屬離子脫落,下次使用前需重新螯和金屬離子。
(4)有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。
上述洗脫方法,均須在緩沖液中加入150~500mmol/L的NaCl以消除離子交換作用。
3.5 再生
(1)多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時,必須將凝膠脫鎳再生。脫鎳方法:首先用5~10個柱床體積的蒸餾水淋洗柱子,然后用5~10個柱床體積的100mmol/L EDTA淋洗柱子,最后用2~3個柱床體積的0.5mol/L NaCl洗掉殘留的EDTA。
(2)多次使用的柱子脫鎳后一般需要清洗。清洗方法:用0.1~1.0 mol/L NaOH反向清洗柱子,50 cm/h保持1~2 h,不僅可以去除結合強的雜質,也可以去除熱源。
(3)清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法:首先用2~5個柱床體積的蒸餾水充分平衡脫鎳后的柱子,然后用0.1~0.3mol/L金屬鹽溶液過柱5~10個柱床體積以螯合金屬離子,最后用5~10個柱床體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。
3.6在位清洗
(1)去除因離子交換作用吸附的蛋白:用2mol/L NaCl溶液反向清洗2~3個柱床體積。
(2)去除強疏水性蛋白和脂質等:用70%乙醇或者30%異丙醇反向清洗4個柱床體積。
(3)除去沉淀蛋白、疏水性蛋白:參照凝膠再生步驟。
3.7存儲
密封保存在4~30℃(保存溶液為20%乙醇)干燥、通風、清潔處,不可冷凍;用過的柱子保存在4~8℃,20%乙醇溶液中。
3.8運輸
運輸中避免日曬、雨淋、重壓,嚴禁與有毒、有害物品混運。
4.注意事項
(1)樣品與Ni Seplife FF(NTA)必須用洗脫緩沖液徹底平衡后,才能進行柱層析。
(2)所裝的柱床必須表面平整,無溝流及氣泡,否則應重裝。
(3)使用時保證柱子和緩沖液的溫度一致,避免柱床內產生氣泡,影響純化效果。
(4)洗脫過程中應嚴格控制流速,且勿過快。
(5)加樣及整個洗脫過程中,嚴防柱面變干。
產品牌號 | 貨號 | 包裝規(guī)格 |
Ni Seplife FF(NTA) | A4023202 | 25ml |
A4023203 | 100ml | |
A4023204 | 500ml | |
A4023205 | 1L | |
A4023206 | 5L | |
A4023207 | 10L |
生產日期:見標簽
使用期限:在適當的貯藏條件下可貯藏5年
注冊人名稱/生產企業(yè):西安藍曉科技新材料股份有限公司
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