疏水層析是利用生物分子表面的疏水性能差異實現(xiàn)分離。在高鹽條件下生物分子吸附在疏水層析介質(zhì)的疏水基團(tuán)上，降低鹽濃度時，不同蛋白按疏水性從弱到強依次被洗脫，從而達(dá)到分離純化的目的。疏水層析操作條件溫和、分辨率高，是生物大分子分離純化常用的方法之一。

Seplife? LXPM Phenyl 5504M層析介質(zhì)是以聚丙烯酸酯為基質(zhì)，在表面進(jìn)行了親水性改性再鍵合苯基疏水基團(tuán)，具有載量高、分辨率高，良好的生物相容性和物理化學(xué)穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)層析填料相比，顯著提高了下游純化工藝的生產(chǎn)效率，廣泛應(yīng)用于抗體、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子的捕獲、中度純化、精細(xì)純化等純化階段。

使用方法

3.1 裝柱

勻漿濃度等于靜置膠體積除以除以勻漿后的總體積。采用0.5M NaCl勻漿可獲得最佳裝柱效果，其濃度為60%-70%。方法如下：

1)色譜柱的柱體積 V，V=Ac×L，Ac=π×r2。

Ac：色譜柱橫截面積；L:色譜柱高度；r：色譜柱半徑。

2) 攪動介質(zhì)形成勻漿液，量取所需質(zhì)量或體積。其為柱體積的1.2倍左右，防止收縮。

3）用 0.5 M NaCl 溶液置換20%乙醇，平衡過夜。

4）裝柱之前，用 0.5 M NaCl 溶液調(diào)整勻漿濃度為 65 ~ 70%；將勻漿一次性倒入層析柱，沉降平衡后標(biāo)注高度。

5）將分配器裝入，調(diào)節(jié)高度使得壓縮系數(shù)為 1.05 ~ 1.10；然后啟動輸液泵，用 1.5~2 倍工作流速使柱床穩(wěn)定。

6）按照 SOP 進(jìn)行柱效和對稱性的測定，須達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。 

3.2 柱效評價 

裝好之后，色譜柱用3-5體積超純水清洗。100cm/h流速平衡并進(jìn)行柱效測試。

離子交換層析柱的柱效測試方法

樣品：      2 M NaCl 溶液 

上樣量：    1~5 % 柱體積 

洗脫液：    0.5 M NaCl 溶液 

線性流速：  100 cm/h 

檢測：      UV @ 280 nm ,2 M NaCl 上樣：電導(dǎo)檢測儀

3.3 清洗 

裝好的色譜柱應(yīng)使用至少使用5BV的去離子水清洗。 

3.4 平衡 

使用適當(dāng)?shù)?-10倍柱體積緩沖液進(jìn)行柱子的平衡，至流出液電導(dǎo)和pH不變（與平衡液一致），如：20 mM PBS + 0.5 M NaCl, pH 7.0 平衡。 

3.5上樣 

固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用 平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應(yīng)經(jīng)離心或膜過濾處理。進(jìn)料量根據(jù)介質(zhì)的載量和料液中目標(biāo)蛋白的含量計算，上樣前確保樣品緩沖液應(yīng)盡可能與平衡液一致。 

3.6洗脫 

上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液淋洗至基線穩(wěn)定，可以根據(jù)實際情況采取降低鹽濃度或改變流動相 pH 的方法依次洗脫吸附于層析介質(zhì)上的樣品。 

3.7再生 

每次層析之后可用 3~5 BV 低離子強度的緩沖液流速再生層析柱，除去疏水結(jié)合較強（可

逆結(jié)合）的蛋白，然后用 5 BV 的去離子水清洗，最后 5 BV 平衡緩沖液平衡層析柱。

3.8 在位清洗 

為了保持層析柱的性能，若有蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)在再生過程中未能有效去除，可執(zhí)行在位清洗步驟，在位清洗時，也可采用反向沖洗的方法，具體操作步驟如下： 

（1）對沉淀蛋白、以疏水性結(jié)合的蛋白或脂蛋白，可用 0.2~0.5 M NaOH 清洗（與層析介質(zhì)接觸時間 1 ~ 2 小時），并用 5 BV 以上平衡液和 3 BV 以上的去離子水清洗；

（2）對強疏水性結(jié)合的蛋白、脂蛋白和脂類物質(zhì)，可用 5 BV 以上的 50%乙醇或 30%異丙醇清洗（與層析介質(zhì)接觸時間 0.5~1 小時），并用 5 BV 以上的去離子水清洗。也可以用含非離子表面活性劑的堿性或酸性溶液清洗，如用 0.1~0.5%的 Triton X-100 + 0.1 M 乙酸清洗 1 ~2 小時，并用 5 BV 以上的 50%乙醇沖洗去除去污劑，然后用 5 BV 以上的純水沖洗（使用高濃度的有機溶劑時，為了避免產(chǎn)生氣泡，應(yīng)采用逐步增加有機溶劑濃度的方法）。

3.9 應(yīng)用案例

（1）5ml  Seplife? LXPM Phenyl 5504M預(yù)裝柱

（2）樣品：核糖核酸酶和溶菌酶混樣

（3）波長：280nm，流速：3ml/min

（4）洗脫：緩沖液A1：20mM PB+1.5M 硫酸銨，pH7.0

緩沖液B1：20mM PB，pH7.0

（5）洗柱溶液：1 M NaOH溶液 超純水

圖1 Seplife? LXPM Phenyl5504M純化蛋白圖譜

備注：紅色曲線：Seplife? LXPM Phenyl5504M

藍(lán)色曲線：某外樣

4.存儲

暫時不使用的層析介質(zhì)需保存在 4～30℃ 的 20%乙醇中，已經(jīng)裝好的層析柱應(yīng)保存在含 20%乙醇的緩沖液(pH 7.0)；使用前請裝柱后將乙醇清洗干凈。

5.運輸

運輸中避免日曬、雨淋、重壓，嚴(yán)禁與有毒、有害物品混運。

生產(chǎn)日期：見標(biāo)簽

使用期限：在適當(dāng)?shù)馁A藏條件下可貯藏5年

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