抗體藥純化工藝過程中常見問題及解決方案

2023-12-11 14:49:21

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mAb純化工藝過程中常見問題及解決方案

單克隆抗體制備過程中，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液經(jīng)過深層過濾等方式進(jìn)行澄清，澄清后用rProtein A Seplife Suno捕獲及初步純化，初步純化在經(jīng)低pH（pH3.4-3.8）滅活病毒，對(duì)于在低pH環(huán)境中不穩(wěn)定的mAb可采用S/D的方式滅活病毒，滅活病毒后用陽(yáng)離子交換 SP Large Scale 吸附洗脫模式繼續(xù)純化，進(jìn)一步去除HCP及親和層析過程中可能脫落的 Protein A 親和配體，同時(shí)陽(yáng)離子交換層析過程通過改變pH的方式洗脫也是去除電荷異構(gòu)體的主要方式，陽(yáng)離子交換層析后用陰離子交換層析Q Large Scale進(jìn)一步精細(xì)純化去除痕量的病毒及HCP等雜質(zhì)，聚集體及片段的去除也多在離子交換層析階段去除。經(jīng)基于Protein A親和層析平臺(tái)技術(shù)的三步層析后，在通過UF/DF的方式置換緩沖液，納濾除病毒等即可制劑化。

mAb純化過程中常見問題

Protein A親和洗脫過程中產(chǎn)生沉淀:

高載量的Protein A親和層析填料結(jié)合mAb的過程中，在填料表面高密度聚集，疏水性強(qiáng)的mAb分子容易高密度聚集沉淀，這個(gè)時(shí)候可以嘗試在洗脫液中添加一些蛋白增溶劑，防止高密度聚體引起的沉淀，如 200mM-500mM 的 Arg 或 1M尿素等。另一方面在低pH洗脫過程中，mAb分子在低pH環(huán)境中不穩(wěn)定時(shí)也容易形成沉淀，這時(shí)可用較高的pH如pH4.0在加一定量如500mM Arg進(jìn)行弱洗脫，同時(shí)洗脫下來要立馬用 1M Tris等緩沖液中和pH。

Protein A親和層析洗脫液中HCP殘留過高：

關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào)，關(guān)注后，在搜索處搜索HCP，查看《抗體純化中Protein A親和層析階段HCP去除策略》推文。另一種方式是親和層析后在進(jìn)行一步深層過濾，這時(shí)選擇的深層過濾膜組件可選擇帶陰離子交換作用的膜組件。

Protein A親和層析洗脫液中聚集體含量偏高：

由于mAb分子在Protein A親和層析填料中高密度產(chǎn)生聚集體，這時(shí)可通過降低mAb的結(jié)合量一方面減少保留時(shí)間另一方面降低上樣量，同時(shí)也可通過在結(jié)合緩沖液中增加一些蛋白增溶劑如尿素，鹽等物質(zhì)減弱mAb分子之間的作用，而減少洗脫液中的聚集體含量。

低pH病毒滅活過程中活性損失大：

在一些mAb分子低pH病毒滅活過程中，由于其AA組成，等電點(diǎn)，穩(wěn)定性等因素可能導(dǎo)致mAb分子降解及聚集等而影響mAb的活性收率，這時(shí)就要考慮其它病毒滅活方式，如S/D。S即solvent，指有機(jī)溶劑，D即detergent，指去垢劑，S/D病毒滅活法即指采用有機(jī)溶劑和/或去垢劑對(duì)產(chǎn)品中可能存在的病毒顆粒進(jìn)行滅活，使其失去感染活性的一種病毒滅活方法。S/D病毒滅活時(shí)，最主要使用的有機(jī)溶劑為TNBP；最主要使用的非離子型去污劑為Triton X-100、Tween 80，其中Triton X-100去垢劑能力更強(qiáng)。病毒滅活時(shí)，TNBP可單獨(dú)使用，也可以與去垢劑中的任意一種聯(lián)合使用。S/D病毒滅活時(shí)，TNBP常用濃度0.1%-0.5%，Triton X-100濃度常用1%。

離子交換層析后電荷異構(gòu)體含量高：

關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào)，關(guān)注后，在搜索處搜索電荷異構(gòu)體，查看《單克隆抗體電荷異構(gòu)體去除策略》推文。

離子交換層析精純后聚集體及片段含量高：

關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào)，關(guān)注后，在搜索處搜索聚集體，查看《抗體藥制備工藝中聚集體及片段的去除解決方案》推文。

精純后一些糖基化分子的去除：

關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào)，關(guān)注后，在搜索處搜索糖基化，查看《糖基化蛋白的分離純化》推文。

小結(jié)：此文總結(jié)是藍(lán)曉科技應(yīng)用開發(fā)部，在純化抗體中多個(gè)項(xiàng)目工藝過程的總結(jié)，在不同的mAb分子純化過程中會(huì)有所差異，僅供參考，更多mAb純化過程中常見問題及解決方案，請(qǐng)留言補(bǔ)充。

mAb下游純化案例

基于Protein A親和平臺(tái)技術(shù)三步層析法純化mAb:

樣品：某mAb原液經(jīng)深層過濾后的上清液

圖1：rProtein A Seplife Suno純化mAb色譜曲線

圖2：SP Large Scale精細(xì)純化mAb色譜曲線

圖3:Q Large Scale精細(xì)純化mAb色譜曲線

圖4：三步層析后HPLC-SEC檢測(cè)圖

純化結(jié)果：mAb三步層析法純化后SEC純度99.15%；總收率 84.50%；HCP殘留5 ppm，如表1.

表1：藍(lán)曉科技三步層析法純化mAb結(jié)果

rProtein A Seplife Suno:

是藍(lán)曉科技應(yīng)對(duì)抗體客戶需求推出的Protein A親和層析填料，以球形，高交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過自主創(chuàng)新技術(shù)將耐堿性重組蛋白A鍵合到該基質(zhì)上。可以特異性地與抗體的Fc區(qū)結(jié)合，用于抗體（單抗和多抗）的分離純化，只需一步親和層析，即可從腹水、血清或培養(yǎng)液等樣品中得到高純度的抗體。在mAb純化中用于捕獲及初步純化，mAb載量高達(dá)80mg/ml。

藍(lán)曉科技自主開發(fā)擁有專利的rProtein A系列蛋白A親和填料于2022年7月14日通過美國(guó)FDA DMF備案（MF#：037326），成為國(guó)內(nèi)為數(shù)不多的通過FDA DMF備案的國(guó)產(chǎn)填料供應(yīng)商。這意味著使用藍(lán)曉科技相關(guān)產(chǎn)品的客戶，在向FDA提交進(jìn)行新藥注冊(cè)的監(jiān)管備案文件中可直接引用DMF備案資料，而無需再提供有關(guān)原料和輔料的具體信息。

rProtein A Seplife Accel 50

藍(lán)曉科技為了滿足單克隆抗體（mAb)，雙特異性抗體（bsAb)，多特異性抗體，抗體偶聯(lián)藥（ADC)等各種抗體藥大規(guī)模生產(chǎn)需求設(shè)計(jì)開發(fā)的以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)為基質(zhì)，偶聯(lián)高耐堿性重組Protein A 配基親和層析介質(zhì)。該產(chǎn)品結(jié)合了藍(lán)曉科技專有噴射法單分散微球制備、精準(zhǔn)造孔、表面修飾（長(zhǎng)鏈間隔臂親水改性），配基偶聯(lián)等技術(shù)使得產(chǎn)品具有高剛性、低反壓、高動(dòng)態(tài)載量、媲美軟膠的生物相溶性，聚體去除效率高等優(yōu)點(diǎn)，與公司瓊脂糖基質(zhì)Protein A親和介質(zhì)形成完整的產(chǎn)品組合，可有效滿足不同客戶多元化的應(yīng)用場(chǎng)景。

SP/Q Large Scale

用于mAb純化過程中精細(xì)純化，去除親和層析過程中可能脫落的Protein A及HCP，電荷異構(gòu)體，聚集體及片段。此系列填料為高剛性瓊脂糖微球填料，耐壓可達(dá)0.5MPa,廣泛用于生物分子的分離純化。

Seplife LXPM Q/SP 5504M/S

聚合物離子交換層析填料，其耐壓可達(dá)0.8MPa，用于mAb中度及精細(xì)純化。

MMC/MA Large Scale

以離子交換為主同時(shí)兼具一定的疏水作用力的多模式層析填料，pH伴隨鹽雙梯度洗脫模式廣泛用于mAb純化過程中聚集體及片段的去除。

Seplife S-200

用于mAb純化過程中精純階段殘留的聚集體及片段的去除。

Boricacid Seplife 4FF及硬膠Boricacid Seplife LXPM 5504

由于硼酸反應(yīng)的專一性，硼酸鹽親和材料近年來受到越來越多的關(guān)注。已證實(shí)硼酸鹽親和材料可以有效分離包括糖蛋白在內(nèi)的含順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物。硼酸分子與糖鏈上的順式二羥基結(jié)構(gòu)在堿性條件下形成環(huán)酯，該生成物在酸性條件下容易水解，反應(yīng)原理如圖2所示?；谠摽赡娣磻?yīng)，可利用硼酸鹽親和材料選擇性檢測(cè)分離富集糖基化蛋白。用于mAb純化過程中糖基化蛋白的去除。