概論

蛋白質(zhì)作為生命活動的主要執(zhí)行者，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生都與其結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)。因此，想要對某一特定的蛋白進行分析與研究則成為一項頗為棘手的問題。

此時，蛋白標簽（Protein tag）開始著手解決這些問題。

蛋白質(zhì)的檢測方法最為應(yīng)用廣泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。免疫分析需要將目標蛋白作為抗原，注射動物，然后從免疫血清中分離抗體，根據(jù)抗原-抗體間的免疫反應(yīng)進行特異性檢測。這種方法最大的缺陷就是每更換一個目標蛋白就要制備一個對應(yīng)的抗體，操作繁瑣，成本昂貴。融合標簽的使用，使蛋白質(zhì)免疫分析走向通用化和便利化。我們將特定的標簽與目標蛋白融合后，兩者是共同表達的，通過檢測融合標簽，可以得到目標蛋白的表達情況。

蛋白標簽（Protein tag）技術(shù)是指利用基因克隆手段，將具有特定功能的多肽，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，甚至完整蛋白質(zhì)與目標蛋白融合在一起，以實現(xiàn)目標蛋白的表達純化，檢測和示蹤等應(yīng)用的技術(shù)。蛋白標簽融合已經(jīng)成為蛋白質(zhì)研究中最常用的技術(shù)之一。

經(jīng)過長期的研究，目前已經(jīng)開發(fā)出一些比較成熟的檢測標簽，下面就挑幾個來介紹一下：

                                           幾種常規(guī)蛋白純化標簽比較

重組蛋白表達常用標簽

HIS標簽

His標簽是當前最為熱門的標簽蛋白之一。His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測；二是構(gòu)成獨特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進行分離純化。

Fc標簽

Fc 片段通過 CH2-CH3 與 FcRn 結(jié)合并呈 pH 依賴性：在 pH 7.4 的生理條件下，F(xiàn)cRn 與Fc 不結(jié)合；在細胞內(nèi)涵體 pH 6.0~6.5 的酸性條件下，兩者結(jié)合，從而避免融合分子在細胞內(nèi)被溶酶體等快速降解。Fc融合蛋白可以通過 Fc 鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接形成穩(wěn)定的二聚體，進一步通過對二硫鍵的基因工程改造和修飾，還可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚體復(fù)合物。Fc 區(qū)域可以獨立折疊，保證伴侶分子體內(nèi)外的穩(wěn)定性。Protein A 親和柱為例，它對于IgG的Fc段具有特異性的親和作用，而對于其他雜蛋白沒有或者只有很弱的結(jié)合，因此當重組蛋白應(yīng)用基因工程技術(shù)與IgG的Fc段進行融合以后也可以被親和柱吸附，簡化了 Fc 融合蛋白的純化步驟。

藍曉科技自主開發(fā)擁有專利的rProtein A系列蛋白A親和填料于2022年7月14日通過美國FDA DMF備案（MF#：037326），成為國內(nèi)為數(shù)不多的通過FDA DMF備案的國產(chǎn)填料供應(yīng)商。這意味著使用藍曉科技相關(guān)產(chǎn)品的客戶，在向FDA提交進行新藥注冊的監(jiān)管備案文件中可直接引用DMF備案資料，而無需再提供有關(guān)原料和輔料的具體信息。

rProtein A Seplife Suno/Suni是藍曉科技應(yīng)對抗體客戶需求推出的Protein A親和層析填料，以球形，高交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過自主創(chuàng)新技術(shù)將耐堿性重組蛋白A鍵合到該基質(zhì)上?？梢蕴禺愋缘嘏c抗體的Fc區(qū)結(jié)合，用于抗體（單抗和多抗）的分離純化，只需一步親和層析，即可從腹水、血清或培養(yǎng)液等樣品中得到高純度的抗體。

具有以下特點

?自主研發(fā)，品質(zhì)保證，專利保證 

?高載量：5min保留時間載量80mg/ml

?耐堿性好：耐受0.5M NaOH

?完整的支持文件：RSF、DMF、MSDS、TSE/BSE

?低配基脫落：小于 2 ppm

?貨期短，1-2周可以交

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Flag-tag

Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。

AviTag

是一個15個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。

SNAP-Tag 

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。 

檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內(nèi)SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經(jīng)純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 

GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）

GST標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。GST融合表達系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。

純化：該表達系統(tǒng)表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。

如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

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GFP

GFP（綠色螢光蛋白）是由下村修等人在水母中發(fā)現(xiàn)的。它在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光。GFP標簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等，相應(yīng)的GFP標簽抗體也被廣泛應(yīng)用。GFP在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質(zhì)之間相互作用和構(gòu)象變化中，起到了重要的作用。

常規(guī)化的c-Myc

C-Myc標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，它作為抗原表位表達在不同的蛋白質(zhì)框架中可識別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細胞計量術(shù)中，可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細胞中的表達。

 熒光素酶（luciferase）:

來源于生物體內(nèi)的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標簽不同，使用熒光素酶構(gòu)建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調(diào)控，因為它們對目的基因的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡單的開和關(guān)兩種狀態(tài)。

廣泛使用的融合標簽的分子量比較

概論

1、首先，需要確定融合標簽的目的

蛋白純化 ：標簽的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHis Tag常被用于細胞內(nèi)源蛋白的純化。6XHis Tag也廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的蛋白純化。可是哺乳動物細胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景，因此極少使用6XHis Tag。

Western Blot檢測：若需要做Western Blot實驗來檢測細胞裂解物中蛋白的表達，你可以選擇有匹配的抗體的小分子標簽。FLAG? Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業(yè)化的抗體等優(yōu)勢，成為Western Blot實驗中常用的Tag。

免疫沉淀反應(yīng)：FLAG? Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業(yè)用抗體等優(yōu)勢成為免疫沉淀反應(yīng)中最常用的Tag. 其他常用的標簽有：HA和cMyc.

該圖顯示了免疫共沉淀的步驟。首先，裂解您的樣本，以釋放蛋白。向試管中添加裂解液的同時，加入靶向融合標簽的抗體，抗體會識別融合標簽。然后抗體與蛋白 A 或 G 偶聯(lián)微珠結(jié)合，后者拉出您的目標蛋白，以及與之復(fù)合的其他蛋白。

活細胞成像：熒光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活細胞成像常用的標記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些紅色變體，如dTomato和mCherry.

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2、考慮融合標簽的影響

任何一類標簽處于氨基酸序列的任一位置，都具有影響目的蛋白表達或功能的可能性。最主要原因是標簽可能會干擾蛋白的正確折疊，致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次，標簽可能會中斷亞細胞定位信號，這種情況下，蛋白能夠正確翻譯和折疊，但在細胞內(nèi)所處的位置是錯誤的。因此，您需要知道添加的標簽對目的蛋白的表達是否有影響。

3、考慮是在N-端還是C-端標記

N-端或C-端標記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、定位等特性。然而，倘若你沒有確切的蛋白結(jié)構(gòu)，或蛋白功能域圖譜，建議分別構(gòu)建N-端標記和C-端標記的表達克隆，以檢測哪個更有效。