概論

在結(jié)構(gòu)研究和體外生物化學(xué)分析等很多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中都需要用到純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以從組織中獲取，亦或更經(jīng)常的是從模式生物中過量表達(dá)獲得，如細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)等。蛋白質(zhì)純化主要是根據(jù)它們各不相同的物理性質(zhì)來從原料進(jìn)行分離，其目的就是希望能浪費(fèi)最少的雜蛋白，獲得最多的功能蛋白質(zhì)。

親和層析

親和層析主要依靠蛋白質(zhì)與介質(zhì)配體間特異性的可逆結(jié)合作用進(jìn)行分離。配體可直接與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析通常是一種最粗放的純化過程，一般在純化工藝的前期應(yīng)用?；诤罄m(xù)應(yīng)用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質(zhì)。

親和層析的固定相是一種共價(jià)結(jié)合特異性配體的惰性介質(zhì)，該配體可與一個(gè)蛋白質(zhì)或一類蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。惰性介質(zhì)通常是交聯(lián)的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質(zhì)可采用選擇性或非選擇性模式來進(jìn)行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對蛋白質(zhì)有特異性作用的配體或共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結(jié)合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類蛋白都具有相似的結(jié)合能力。

圖 1. 用蛋白A、G、L進(jìn)行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個(gè)功能區(qū)：一類蛋白質(zhì)的Fc區(qū)（片段，恒定區(qū)） 都是相同的，F(xiàn)v區(qū)（片段，可變區(qū)）是每個(gè)抗體各不相同的特異區(qū)，F(xiàn)ab（片段，抗原區(qū)）是抗體實(shí)際與特異性抗原結(jié)合的區(qū)域。B.抗體的特異性區(qū)域可以通過親和色譜進(jìn)行非選擇性純化，在該過程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結(jié)合在分離介質(zhì)上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。

兩類親和色譜中，在不影響蛋白質(zhì)（或標(biāo)簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質(zhì)均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對所有結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行淋洗。最后用含有競爭分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質(zhì)間相互作用的條件對結(jié)合蛋白進(jìn)行洗脫。競爭分子可代替目標(biāo)蛋白與配體相結(jié)合。這種競爭分子可通過其他層析手段或者透析的方式從目標(biāo)蛋白中去除。通過破壞所有蛋白間相互作用來從固定相洗脫蛋白的方法包括調(diào)節(jié)緩沖液的pH值或者離子強(qiáng)度。因?yàn)檫@些方法同樣會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，因此通常建議洗脫下來的蛋白質(zhì)要立即中和或者稀釋以將危害降到最小。有報(bào)道稱，對于不同形式的親和層析，為獲得最高產(chǎn)率的活性蛋白需采用多種不同的流動相條件 [13, 14] 。

設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，即可在其N端或C端（或在少數(shù)情況下，在結(jié)構(gòu)已知蛋白質(zhì)的柔性環(huán)狀區(qū)域） 引入親和標(biāo)簽以助于純化。

抗體通常是基于抗體與其抗原 （抗體識別的序列） 間的高特異性相互作用來進(jìn)行純化。一個(gè)含有抗原的多肽可以與帶有抗體特異結(jié)合位點(diǎn)的介質(zhì)相結(jié)合。降低流動相緩沖液的pH值可破壞抗體/多肽間相互作用力，釋放出結(jié)合抗體。商業(yè)上，該方法常用于血清原液中抗體的純化。

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高載量，高耐堿性，完善的支持文件。

蛋白質(zhì)同樣可通過非選擇性方式進(jìn)行親和純化。在非選擇性純化過程中，固定相上結(jié)合的配體可以與一類具有類似結(jié)合部位的蛋白質(zhì)相結(jié)合。DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的純化就是一個(gè)非選擇性親和層析的實(shí)例。因?yàn)楦嗡嘏cDNA的結(jié)構(gòu)和電荷極為類似，它可以被作為DNA結(jié)合蛋白質(zhì)親和層析的配體。由于所有的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)理論上都可以與該固定相結(jié)合，幾乎其他所有蛋白質(zhì)都會穿透而不與介質(zhì)結(jié)合，從而可達(dá)到目標(biāo)蛋白產(chǎn)率最大程度的富集。另一個(gè)例子是抗體通過其恒定區(qū) （Fc）與配體間的相互作用進(jìn)行富集濃縮，蛋白A、G、L都是常用的配體。

當(dāng)采用類似的結(jié)合模式（抗體與蛋白A、 G或 L配體結(jié)合）時(shí)，抗體的抗原結(jié)合區(qū)（Fab）仍然保持與其特異性抗原結(jié)合的能力。因此，特異性蛋白可通過配體/抗體結(jié)合和抗體的抗原間的特異性相互作用來純化。

常見問題及解決方式見表2。

離子交換層析

離子交換層析分離蛋白的原理是基于其凈電荷的不同，通過蛋白質(zhì)與帶電荷的固定相之間的靜電作用力進(jìn)行分離。IEX有以下兩類: （1）陰離子交換層析 （固定相帶正電荷，與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）；（2）陽離子交換層析（固定相帶負(fù)電，與帶正電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）。離子交換層析常用于蛋白質(zhì)純化工藝中期。但是，對某些蛋白，在純化工藝的前期或后期采用該方法亦可獲得良好的分離效果。

圖 2. 蛋白質(zhì)凈電荷受其溶劑pH值影響。當(dāng)pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)凈電荷為0，因此既不與陰離子交換的固定相也不與陽離子交換的固定相相結(jié)合。調(diào)節(jié)pH值高于或低于pI值可使蛋白質(zhì)帶上凈電荷，使其與陰離子交換樹脂（pH > pI）的固定相或者陽離子交換（pH < pI）的固定相相結(jié)合。

由于氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和與其共價(jià)結(jié)合的修飾成分的影響，所有的蛋白質(zhì)都會帶有凈電荷。由于溶劑可以與蛋白質(zhì)相互交換氫離子，因此蛋白質(zhì)的凈電荷受其溶劑pH值的影響。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）是蛋白質(zhì)不帶電時(shí)的pH值。當(dāng)pH值高于pI時(shí)，蛋白質(zhì)會帶負(fù)電，而當(dāng)pH值低于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電。因此，可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來控制結(jié)合蛋白是與離子交換柱結(jié)合或是從柱上洗脫。

SP Large Scale 

高剛性瓊脂糖微球離子交換介質(zhì)

理論上來說，只要緩沖液pH值調(diào)節(jié)合適，所有的蛋白質(zhì)都可以與陽離子交換柱和陰離子交換柱結(jié)合。但是，蛋白質(zhì)純化過程中，選擇純化條件和層析柱類型時(shí)最重要的考慮因素就是要保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性是必須要考量的。通常，一些與某類離子交換層析相結(jié)合的條件可能對某種蛋白質(zhì)比對其他蛋白質(zhì)更為合適。

了解蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的知識可幫助尋找最合適的離子交換層析方法。以下在線工具可計(jì)算一個(gè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn) EXPASY。這些計(jì)算都完全基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，不考慮其三維空間結(jié)構(gòu)。而在實(shí)際情況中，一個(gè)蛋白質(zhì)的某些殘基可能暴露得比其他部分更多，所以，其實(shí)際pI和表面凈電荷某些時(shí)候可能與理論計(jì)算值不盡相符 [19] 。氨基酸的相對位置分布同樣會影響一個(gè)蛋白質(zhì)的pI值 [20] ，而這一點(diǎn)在理論計(jì)算時(shí)同樣未予考慮。有些技術(shù)可通過實(shí)驗(yàn)方法測得蛋白質(zhì)實(shí)際的pI值，如等電聚焦電泳 [21] 、等電聚焦毛細(xì)管電泳 [22] 和高通量光學(xué)測量法等 [23] 。

蛋白質(zhì)與IEX的結(jié)合必須采用較寬pH值范圍的溶液進(jìn)行多次嘗試以獲得最合適的蛋白質(zhì)保留pH值。在pI值左右1個(gè)pH單位的溶液pH值通常認(rèn)為是較合適的蛋白質(zhì)結(jié)合pH值 [24] 。但是，在有些情況下，也可能需要在遠(yuǎn)離pI值的pH值條件下進(jìn)行 [25] 。

圖 3. 離子交換層析。蛋白質(zhì)在低離子強(qiáng)度條件下與帶電的固定相相結(jié)合。結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過增加緩沖液的離子強(qiáng)度或者調(diào)節(jié)其pH值進(jìn)行洗脫。

IEX的固定相是由惰性瓊脂糖或者高分子基質(zhì)與帶電基團(tuán)共價(jià)結(jié)合組成。介質(zhì)微粒有很多尺寸，可以無孔，也可以有多種不同尺寸的孔。介質(zhì)的選擇主要根據(jù)所需的結(jié)合能力、分辨率和流速要求來決定。介質(zhì)顆粒尺寸越小，分辨率越高，但相應(yīng)的流速也越低，分離時(shí)間也更長。多孔介質(zhì)比無孔介質(zhì)的結(jié)合能力更強(qiáng)。無孔介質(zhì)中，蛋白質(zhì)不能進(jìn)入樹脂內(nèi)部，因此相比多孔介質(zhì)，前者的樣品回收率更高，分辨率更高，分離時(shí)間也更短。一個(gè)研究表明，對于大多數(shù)蛋白質(zhì)，采用無孔介質(zhì)和多孔介質(zhì)的分辨率和回收率都類似，但對于尺寸較大的蛋白質(zhì)，多孔介質(zhì)由于體積排阻效應(yīng)而在分辨率上有一定損失 [26] 。

IEX中最常用的4種帶電官能團(tuán)如下所示。它們根據(jù)離子交換能力的強(qiáng)弱分類，強(qiáng)離子交換基團(tuán)可離子化的pH范圍比弱離子交換基團(tuán)的范圍更大。

陰離子交換 （固定相帶正電）:

1、季銨（Q） - 強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)

2、二乙氨乙基（DEAE） -弱陰離子交換基團(tuán)

陽離子交換 （固定相帶負(fù)電）:

1、磺酸甲酯（S） -強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)

2、羧甲基（CM） - 弱陽離子交換基團(tuán)

因?yàn)閺?qiáng)離子交換基團(tuán)的活性基團(tuán)在很大的pH范圍內(nèi)均可保持帶電，它可以在蛋白質(zhì)結(jié)合所需pH值是特別強(qiáng)的酸性或堿性的情況下使用（假設(shè)該pH值下蛋白質(zhì)穩(wěn)定性仍得以保持）, [27] 。有些蛋白質(zhì)在弱離子交換上的保留較弱，使得它們可以用較低的離子強(qiáng)度洗脫 [28] 。由于高離子強(qiáng)度會影響部分蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 [29] ，而弱離子交換不需要在極端的pH值條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此可能對蛋白質(zhì)更合適。

離子交換色譜的固定相首先用低離子強(qiáng)度的緩沖液平衡，然后將蛋白質(zhì)樣品用和平衡過程相同離子強(qiáng)度的緩沖液上樣到固定相。結(jié)合的蛋白質(zhì)在用更高離子強(qiáng)度或pH值不同（圖6）的緩沖液洗脫前先淋洗一段時(shí)間。洗脫緩沖液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白質(zhì)。在離子交換層析中，某些鹽類代替結(jié)合蛋白和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力，可能比其他種類的鹽可能更有效 [30] 。NaCl或KCl是洗脫液中最常用的鹽類，其中Na+或K+是陽離子交換層析中的抗衡離子，Cl-是陰離子交換層析中的抗衡離子。另一方面，還可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的pH值來減少蛋白質(zhì)的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對于結(jié)合到陽離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，增加緩沖液pH值會使蛋白質(zhì)所帶正電荷減少，因此可將其從柱上洗脫下來。對于結(jié)合到陰離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，降低pH值可減少蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷將其從柱上洗脫下來。

同時(shí)，還可以調(diào)節(jié)緩沖液的pH值使目標(biāo)蛋白質(zhì)不與離子交換固定相相結(jié)合，而與此同時(shí)雜蛋白與固定相結(jié)合。如此，可在穿透液中收集目標(biāo)蛋白質(zhì)，而雜蛋白通過與固定相結(jié)合得以去除。

與其他層析方法相比，離子交換層析在確定蛋白質(zhì)結(jié)合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的最佳條件時(shí)可能需要解決更多的問題。

疏水層析

疏水作用層析（HIC）分離蛋白質(zhì)主要是基于它們疏水性的不同。它常在蛋白質(zhì)純化工藝的中期使用。在HIC中，蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的緩沖液中與固定相結(jié)合，因此，無需更換緩沖液或者洗脫液即可在離子交換色譜之后直接應(yīng)用HIC。同樣，HIC也可以跟在通過用鹽類沉淀快速去除部分而非全部蛋白質(zhì)的硫酸銨沉淀步驟之后實(shí)施。HIC有時(shí)在純化工藝的前期使用，有時(shí)也作為最后一個(gè)步驟來去除目標(biāo)蛋白中的微量雜質(zhì)。

溶液中存在的鹽離子可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分去折疊，暴露出部分常規(guī)情況下隱藏于內(nèi)部的疏水殘基。當(dāng)加入離子強(qiáng)度較低的緩沖液時(shí)，結(jié)合到固定相的蛋白質(zhì)恢復(fù)到原折疊結(jié)構(gòu)。由此，可減少其可與固定相相互作用的疏水殘基的暴露，有利于蛋白質(zhì)從固定相上洗脫下來。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可以隨著離子強(qiáng)度的降低而自動地再折疊回原結(jié)構(gòu)，所以HIC是一種非常有價(jià)值的一種蛋白質(zhì)純化手段。

圖 4. 逐漸降低鹽（硫酸銨）濃度梯度從疏水柱上洗脫下的蛋白質(zhì)。收集的組分需進(jìn)行蛋白濃度和目標(biāo)蛋白特異性活性的檢測。根據(jù)蛋白質(zhì)活性檢測結(jié)果，目標(biāo)蛋白的濃度在第45組組分中達(dá)到最高。

離子強(qiáng)度應(yīng)該盡量低，使其可以促使目標(biāo)蛋白結(jié)合，同時(shí)又不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。如果結(jié)合所需離子強(qiáng)度高到導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的沉淀，可以使用略低的離子強(qiáng)度。這種情況下，層析過程可以將所有結(jié)合蛋白質(zhì)與穿透的未結(jié)合目標(biāo)蛋白分離開。

Phenyl Seplife FF(HS)

瓊脂糖微球疏水層析介質(zhì)

在層析柱上樣前，固定相必須用高離子強(qiáng)度的緩沖鹽平衡（蛋白質(zhì)樣品所使用的相同的緩沖液），然后柱上上樣，并淋洗一段時(shí)間后，再用較低離子強(qiáng)度的緩沖液將蛋白質(zhì)洗脫（圖 7、8）。

圖 5. 疏水作用層析。在高離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)部分去溶劑化，使其通常隱藏在內(nèi)部的疏水部分更多地暴露出來。這些殘基會與介質(zhì)上的疏水官能團(tuán)發(fā)生疏水相互作用。降低離子強(qiáng)度可以使蛋白質(zhì)重新隱藏其疏水部分，折疊回復(fù)原結(jié)構(gòu)。這會降低蛋白質(zhì)與固定相之間的疏水相互作用，完成蛋白質(zhì)的洗脫。

疏水作用層析的固定相是由交聯(lián)的瓊脂糖或合成的共聚高分子的骨架組成。骨架上共價(jià)連接上烷基或者芳香基的配體，以便與疏水性分子產(chǎn)生特異性相互作用。

官能團(tuán)的種類包括：

1、烷基 - 不同長度的碳?xì)滏溄Y(jié)構(gòu)，通常為丁基或者辛基。固定相的結(jié)合能力隨著烷基鏈的增長而增加 [31] 。官能團(tuán)結(jié)合蛋白的能力主要是基于蛋白質(zhì)的疏水性

2、芳香基 - 一種由芳環(huán)衍生而來的官能團(tuán)，通常為芐基。芳香基的特異性通常更高，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)還可以通過基本的堆積作用與該官能團(tuán)相互作用。

每一種蛋白的結(jié)合和洗脫緩沖液所用鹽的種類和濃度都應(yīng)經(jīng)由實(shí)際實(shí)驗(yàn)確定。此外，蛋白質(zhì)的再折疊和活性在洗脫后都必須得到保證。

和其他柱層析類似，優(yōu)化HIC工藝時(shí)也需要解決大量的問題。每一種蛋白都需要調(diào)節(jié)緩沖液條件和固定相以保證獲得最優(yōu)化的分離。

凝膠過濾層析

凝膠過濾又稱為分子篩及體積排阻，體積排阻層析是根據(jù)蛋白質(zhì)具有不同的水力學(xué)半徑將它們進(jìn)行分離，該數(shù)據(jù)主要通過測量分子尺寸和形狀兩方面信息獲得。與上述其他層析過程不同的是，蛋白質(zhì)不與SEC的固定相相結(jié)合，而是依靠它們通過惰性固定相的速度不同來完成分離。

圖 9. 三種不同水力學(xué)半徑的蛋白質(zhì)混合物用體積排阻色譜柱分離。大蛋白因?yàn)椴荒苓M(jìn)入介質(zhì)孔道內(nèi)部而只能直接流經(jīng)柱體最先流出。稍小的蛋白質(zhì)會進(jìn)入介質(zhì)孔道內(nèi)部，流經(jīng)的路徑更復(fù)雜，因此需要更多的時(shí)間來穿過介質(zhì)并流出柱體

基于SEC可分辨不同種類蛋白的能力，它通常是一種用于最后一步純化的有效方法。低聚物 [32] 、去折疊的蛋白分子 [33] 和缺失蛋白 [34] 都可以在逐漸置換緩沖液的過程中與結(jié)構(gòu)完整的天然蛋白質(zhì)分子分離開。通常，由于SEC可使用溶劑種類更多，所用的緩沖鹽也更少，因此比透析的緩沖液置換過程更快也更可靠。整個(gè)SEC過程都只使用一種溶劑，而市購的SEC固定相幾乎與所有常規(guī)的緩沖液兼容。

固定相的類型和柱子的長度對蛋白質(zhì)的SEC分離的分辨率有很大的影響。市場上有很多種固定相可選，其選擇最好是根據(jù)待分離蛋白質(zhì)分子的分子量和分離條件兩方面來決定。

Seplife 6FF

超螺旋質(zhì)粒，病毒等凝膠過濾層析分離介質(zhì)

與其他層析方法一樣，SEC同樣既有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)。是否采用SEC要取決于蛋白質(zhì)本身及其后續(xù)應(yīng)用的要求。

SEC的優(yōu)點(diǎn)：

1、可進(jìn)行緩沖液交換和脫鹽。

2、可分離其他純化技術(shù)難以分離的相似品種（如蛋白片段和低聚物）。

3、可與多種溶劑相容。

4、不依賴于蛋白質(zhì)的任何一種特殊形式進(jìn)行保留和洗脫。

SEC的缺點(diǎn):

1、分離效果嚴(yán)重依賴柱子的填裝效果。

2、蛋白質(zhì)與介質(zhì)間有非特異性相互作用，會降低分辨率。

3、對復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分辨率低。

4、為保證足夠的分辨率，上樣量必須較小。這對沉淀得到的高濃度蛋白質(zhì)是一個(gè)問題。

要優(yōu)化SEC條件以獲得最好的分離效果，常常需要耗費(fèi)大量時(shí)間，而一些因素會對分離效果產(chǎn)生非常大的影響。

提高SEC分離效果的條件:

1、上樣體積盡量最小。上樣體積越小，洗脫組分的擴(kuò)散將會越弱。

2、緩沖液中加鹽。少量的鹽有助于防止蛋白質(zhì)與固定相間的非特異性相互作用。這將保證所有的蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定地流過整個(gè)層析柱。

3、采用合適的流速。流速過快使得小分子沒有足夠的時(shí)間流經(jīng)介質(zhì)孔道，流速過慢則會導(dǎo)致樣品擴(kuò)散時(shí)間增加。

4、保證樣品和溶劑的黏度接近。調(diào)整樣品的條件使其與洗脫緩沖液的類似。

5、調(diào)整層析柱長度。柱子過短使蛋白質(zhì)分離不充分。而柱子過長則使得蛋白質(zhì)樣品擴(kuò)散嚴(yán)重。

6、重裝柱子。柱子的填裝效果會蛋白質(zhì)的分離效果有相當(dāng)大的影響。

如果介質(zhì)顆粒沒有分布均勻或者填裝時(shí)帶入氣泡，蛋白質(zhì)將不能順利地流過固定相。此外，如果柱子跑干了，就必須重裝。柱子填裝不好通常就是分離效果不好的原因。

由于SEC并不是基于蛋白質(zhì)官能團(tuán)間的相互作用來進(jìn)行分離，所有的蛋白質(zhì)都在相同的條件下進(jìn)行洗脫，所以分離效果僅僅依賴于蛋白質(zhì)各自不同的水力學(xué)半徑。因此，SEC通常不適合在含有較多雜蛋白的純化工藝前期使用。但是，SEC又可作為一種快速可靠的樣品脫鹽或者小分子去除方法用于分離工藝前或中期。在純化的最后階段，當(dāng)只剩痕量雜蛋白時(shí)，SEC則是一種蛋白質(zhì)分離和置換保存緩沖液的有效方法。

蛋白質(zhì)洗脫方法

固定相上結(jié)合的蛋白質(zhì)要用可破壞結(jié)合作用力的溶劑條件進(jìn)行洗脫。這些流動相的條件要根據(jù)層析類型和目標(biāo)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來選擇。蛋白質(zhì)洗脫方法通常包括以下三種：批次洗脫，階梯式洗脫和線性梯度洗脫。如何選擇最好的方法要依靠采用的層析方式和所需的分離效果來決定。

1、批次洗脫 - 一步即將所有結(jié)合蛋白質(zhì)一次性洗脫?；谔禺愋韵嗷プ饔?（如親層析）的層析方法最好采用這種方式。批次洗脫法沒有任何分離效果，但它可以很好地快速去除雜質(zhì)。它需要事先了解取代目標(biāo)蛋白所需的緩沖液條件。

2、階梯式洗脫 - 連續(xù)進(jìn)行多步批次洗脫，并每次逐漸增強(qiáng)洗脫條件。在階梯式洗脫中，收集的組分?jǐn)?shù)取決于連續(xù)批次洗脫的次數(shù)。階梯式洗脫比批次洗脫的分離效果要好，但比線性梯度洗脫的效果要差。

3、線性梯度洗脫 - 當(dāng)流動相以線性梯度洗脫時(shí)可收集多種連續(xù)流出的組分。對于離子交換層析和疏水作用層析，線性梯度洗脫可以獲得最好的分離效果，同時(shí)，它還可以收集到大量的連續(xù)組分。

由于體積排阻層析中蛋白質(zhì)和固定相之間不存在相互作用，因此不需要采用任何一種上述洗脫方法。蛋白質(zhì)上樣后，無需改變洗脫緩沖液的條件，即可連續(xù)不斷地收集各分離組分至所有蛋白質(zhì)全部被洗脫為止

理想的情況是這根層析柱所采用的洗脫緩沖液同樣可用于后續(xù)的層析柱，由此可省去兩步之間必須的緩沖液置換或者透析操作。

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