簡(jiǎn)介

設(shè)計(jì)、構(gòu)建和運(yùn)行那些特定的、靈敏的和有效的檢測(cè)方法在所有的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都是至關(guān)重要的。例如，在基礎(chǔ)研究應(yīng)用中，可能需要在細(xì)胞水平上對(duì)一種特定蛋白進(jìn)行定量，來確定在血清或者尿液中一種代謝物的水平，或者比較一種酶在正常和患病組織中的催化活性 [1] 。制藥和生物技術(shù)行業(yè)鑒定和描述潛在的新藥分子 [2, 3] 。其他的研究可能需要定量測(cè)定基因表達(dá)水平 [4] 。 

當(dāng)發(fā)展一種生物檢測(cè)時(shí)，不管是怎樣特殊的用途或者是測(cè)定特別的分子，必須考慮一些基本因素。不僅對(duì)檢測(cè)本身，同時(shí)對(duì)包括從樣品準(zhǔn)備到檢測(cè)提供的數(shù)據(jù)質(zhì)量的分析的整個(gè)工作流程都需注意。這篇文章討論的檢測(cè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有普遍的適用性。對(duì)任何類型檢測(cè)開發(fā)都是有效的（例如以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法， 如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和電化學(xué)分析，總蛋白／蛋白濃度的測(cè)定，酶活測(cè)定，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)或者定量PCR）。同樣的，無論是基于吸光度、熒光性、放射性甚至是質(zhì)譜分析的檢測(cè)系統(tǒng)，這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)都是有效的。每一種特定的檢測(cè)都有它自己的特性，但是通過密切注意以下討論的要點(diǎn)，研究人員可以確保開發(fā)一種有效的可靠的適合的檢測(cè)方法。通常都已有用特定技術(shù)來開發(fā)某個(gè)檢測(cè)方法的指導(dǎo)方針或具體的討論， 例如針對(duì)肽質(zhì)譜測(cè)量的討論[5] 。

檢測(cè)方法設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

與目標(biāo)成分相關(guān)的注意事項(xiàng) 

當(dāng)著手開始實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)時(shí)，研究者需要考慮許多問題以明確實(shí)驗(yàn)的確切需求。

表一. 待測(cè)成分

需要檢測(cè)哪些成分和參數(shù)？

開始時(shí)便需要絕對(duì)清楚要研究的成分以及將要檢測(cè)該成分的何種特性。這聽起來理所當(dāng)然，但卻是首要的問題，并且是所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的基礎(chǔ)。比如，研究者是希望檢測(cè)細(xì)胞裂解產(chǎn)物中特定蛋白的總量亦或只是磷酸化形式，還是需要兩者兼顧 [6, 7] ? 研究可能需要檢測(cè)特定的亞型或目標(biāo)蛋白不同的剪接體 [8, 9] 。就一種蛋白質(zhì)而言，要明確待測(cè)參數(shù)是蛋白含量還是蛋白的生物學(xué)功能，如酶活性或是一種細(xì)胞因子對(duì)潛在細(xì)胞靶點(diǎn)的影響?；蛟SmRNA水平檢測(cè)基因表達(dá)的情況也滿足要求。研究也可能需要設(shè)計(jì)不同的實(shí)驗(yàn)以分別檢測(cè)基因表達(dá)，穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)的水平以及生物學(xué)功能 [7, 10, 11] ; 每一種實(shí)驗(yàn)都會(huì)提供關(guān)于目標(biāo)分子不同但互補(bǔ)的信息。

成分的來源 

考慮待測(cè)成分的來源很重要。待測(cè)成分存在于體液如血清或尿液中？待測(cè)成分存在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的某一器官中？或是存在于病人的活組織樣本中？或許來源材料是尸體的組織。當(dāng)然來源也可能是體外培養(yǎng)的細(xì)胞，在這種情況下一個(gè)重要的事項(xiàng)是這些細(xì)胞是稀少的原代細(xì)胞還是數(shù)量可控的永生細(xì)胞系。 

成分來源將限定樣品的數(shù)量和可用性。這也會(huì)限定目標(biāo)成分的濃度并嚴(yán)重影響到分子的穩(wěn)定性，這些將在后續(xù)的章節(jié)里討論。因此，目標(biāo)成分的來源很可能對(duì)最終確定的整個(gè)檢測(cè)流程產(chǎn)生深刻影響。

穩(wěn)定性 

了解待測(cè)成分的穩(wěn)定性是很重要的。它相對(duì)穩(wěn)定？還是非常不穩(wěn)定， 因此需要在收集和制備檢測(cè)所需的樣本過程中進(jìn)行特殊處理以獲取有意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)？哪怕在分離狀態(tài)中穩(wěn)定的分子也可能因處于待測(cè)樣品復(fù)雜的生物學(xué)環(huán)境中而變得不穩(wěn)定：它們可能氧化，蛋白質(zhì)水解或是翻譯后修飾丟失的影響。因此有必要在樣品緩沖液中加入如還原性試劑或蛋白酶和／或磷酸酶抑制劑以保證待測(cè)成分在樣品處理和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過程中都處在生理狀態(tài) [12] 。此處成分來源是一個(gè)重要的注意事項(xiàng)；在血清中穩(wěn)定的一種成分可能在肝臟勻漿液中會(huì)變得相當(dāng)不穩(wěn)定。如果采用活組織樣本或是尸體組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，了解組織的處理和存放方式很重要，因?yàn)檫@會(huì)對(duì)某些成分的數(shù)量和質(zhì)量有重大影響。

定量與半定量 

為設(shè)計(jì)出滿足要求的檢測(cè)方法，很重要的一點(diǎn)是在開始階段就要了解對(duì)分子進(jìn)行半定量檢測(cè)如蛋白印跡是否能滿足課題的要求，還是需要更為嚴(yán)格的定量方法。

待測(cè)樣品的數(shù)目 

另一個(gè)重要的注意事項(xiàng)是有多少樣品需要檢測(cè)。如果只是少量樣品需要檢測(cè)，那耗力多步驟的人工方法是完全可以接受的。相反，如果是成千上萬的樣品有待檢測(cè)，或許是化合物分析的一部分，那盡實(shí)驗(yàn)室所能以簡(jiǎn)化，流水線化并自動(dòng)化整個(gè)試驗(yàn)流程將變得很重要。對(duì)與待測(cè)成分相關(guān)的所有這些問題的解答非常關(guān)鍵，這將有助于研究者確定滿足他們特定要求的最合適的方案，并且應(yīng)當(dāng)在考慮下一章節(jié)討論的實(shí)驗(yàn)原理時(shí)牢記在心。

蛋白質(zhì)檢測(cè)的基本原理

在考慮了有關(guān)將被檢測(cè)分子的這些問題之后，必須仔細(xì)注意一些不管是應(yīng)用在感興趣的特殊分子或者是被采用的特定的檢測(cè)格式上的基本技術(shù)／實(shí)際問題。

表二. 檢測(cè)基本原理

特異性 

一個(gè)絕對(duì)關(guān)鍵的考慮因素是該檢測(cè)法的特異性。在完全明確了需測(cè)量分子以及分子的參數(shù)之后，研究者需要建立一個(gè)將只測(cè)量他們想要測(cè)量的而沒有其他的檢測(cè)方法。如果這種檢測(cè)法同時(shí)測(cè)量所需分子和其他分子，可能需要采取手段去提高檢測(cè)的特異性。 

需要考慮兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的檢測(cè)特異性的問題。

首先，主要的檢測(cè)試劑是否有相應(yīng)的特定性？例如，在基于高效液相色譜檢測(cè)法的情況下，一個(gè)研究員是該有多么自信才會(huì)認(rèn)定一個(gè)出現(xiàn)在特別停留時(shí)間上的峰是他感興趣的分子而不是另一個(gè)只是碰巧與感興趣分子共提出來的分子。這里需要考慮分析物的來源。尿液樣本的分析可能不會(huì)引起因?yàn)楹透信d趣分子共洗脫而出現(xiàn)的峰。然而，用相同檢測(cè)手段分析血清或組織勻漿樣品可能未必真實(shí)了。在基于抗體的檢測(cè)中，問題是，所采用的抗體是否對(duì)靶蛋白有絕對(duì)特異或者它也能與其他蛋白交互反應(yīng)？有可能所得的抗體是特異于某種特定蛋白或者某種特定的翻譯后修飾，例如特定位點(diǎn)的磷酸化作用或者基于蛋白酶而裂解產(chǎn)生的新抗原 [10, 11] 。

這類抗體試劑必須根據(jù)實(shí)際檢測(cè)條件嚴(yán)格定性以確保它們有所需的特異性，只與所需的產(chǎn)物而不是與基質(zhì)／前提分子起反應(yīng)。在不使用抗體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中，例如熒光多肽裂解實(shí)驗(yàn)，特異性程度會(huì)降低很多。取代在特定位點(diǎn)裂解以產(chǎn)生信號(hào)，如今在多肽內(nèi)任何位點(diǎn)裂解也會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。這產(chǎn)生了有關(guān)檢測(cè)特異性的第二個(gè)方面，即為一個(gè)在體外酶檢測(cè)的具體問題。即使檢測(cè)試劑在想要檢測(cè)的某一特定項(xiàng)目中有特異性，很可能在初始細(xì)胞裂解物或者組織勻漿中，多種酶能產(chǎn)生相同的效果（例如磷酸化作用，蛋白水解或者其他翻譯后修飾）。這個(gè)問題甚至?xí)壬厦媪谐龅臒晒怆牧呀鉁y(cè)試?yán)痈怀?。初始裂解物中的多重重?fù)活性這一問題常常能通過列入一額外的樣品處理步驟被克服，例如特定的免疫沉淀，以達(dá)到所要求的檢測(cè)特異性 [12] 。此外，根據(jù)研究的性質(zhì)，最好的解決方案可能是運(yùn)用使用高純度（天然或重組）酶的活性檢測(cè)。

靈敏度 

檢測(cè)需要有多高的靈敏度？這將取決于樣品中所感興趣分子的水平和可得的樣品量。重要的一點(diǎn)是，檢測(cè)方法必須足夠靈敏，如此才能使待測(cè)組分的水平與檢測(cè)方法的動(dòng)態(tài)區(qū)間很好的吻合（見下文）。在決定測(cè)驗(yàn)版式和檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，這是一項(xiàng)重要的考慮因素。如果相比較吸光度，要求更高的熒光性靈敏度，讀數(shù)更可能要給出所需的靈敏度。通過利用酶原始信號(hào)的擴(kuò)增，也能提升靈敏度 [13, 14] 。這種“耦合”的檢測(cè)系統(tǒng)可以非常敏感，但同時(shí)也會(huì)提升檢測(cè)樣品干擾試驗(yàn)的幾率（見下文）。

動(dòng)態(tài)區(qū)間 

確定檢測(cè)的動(dòng)態(tài)區(qū)間很重要。換句話說，檢測(cè)讀數(shù)范圍與樣品中被分析的靶向分子的數(shù)量成正比。在一個(gè)測(cè)量分子濃度的實(shí)驗(yàn)中，如圖1這個(gè)假設(shè)的例子，檢測(cè)過程（無論采用什么版式）通過構(gòu)建一個(gè)合適的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行適當(dāng)校準(zhǔn)是重要的。同樣地，在一個(gè)酶試驗(yàn)中，必須確保試驗(yàn)在一個(gè)區(qū)間中進(jìn)行，如此才能測(cè)定最初的反應(yīng)比率，使得測(cè)定比率與加入檢測(cè)的酶總量成正比。為了在檢測(cè)的動(dòng)態(tài)區(qū)間內(nèi)，樣品可能需要被稀釋或者濃縮。如果待測(cè)分子在不同樣品中的水平非常不同可能會(huì)是一個(gè)很特殊的問題。不能落在檢測(cè)的動(dòng)態(tài)區(qū)間內(nèi)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性數(shù)據(jù)。

干擾檢測(cè)讀值的因素 

設(shè)計(jì)檢測(cè)方法時(shí)，考慮哪些可能干擾讀值從而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的因素非常重要。檢測(cè)方法的特異性已在上文討論。此處我們將討論其它可能干擾檢測(cè)讀值的因素。

圖 1. 檢測(cè)校準(zhǔn)/動(dòng)態(tài)區(qū)間。

在熒光讀值實(shí)驗(yàn)中，保證待測(cè)樣品不會(huì)使熒光淬滅是很重要的。這可能是使用粗提的細(xì)胞裂解液或是組織勻漿進(jìn)行檢測(cè)時(shí)會(huì)遇到的特定問題。類似的，在用于化合物篩選或分析的熒光酶活或是細(xì)胞檢測(cè)中，研究者需要盡可能的保證檢測(cè)化合物不會(huì)使熒光讀值淬滅。這些化合物會(huì)表現(xiàn)出表觀抑制活性然而實(shí)際上它們對(duì)目標(biāo)靶點(diǎn)沒有直接的抑制效果。某些化合物本身便有熒光因此會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢測(cè)信號(hào)。這類化合物干擾可利用在稍長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)的熒光報(bào)告子加以降低 [15]. 另一個(gè)普遍的問題是樣品組分的干擾如還原性試劑或去垢劑對(duì)某些常用的 蛋白檢測(cè)方法的干擾。

在酶耦聯(lián)的檢測(cè)中（酶活或是代謝產(chǎn)物檢測(cè)），確保耦聯(lián)酶不會(huì)檢測(cè)除了樣品中目標(biāo)成分之外的組分是非常關(guān)鍵的。如果這些檢測(cè)手段被用于化合物篩選或分析，那重要的一點(diǎn)是確保這些檢測(cè)方法得到合理配置因此它們只檢測(cè)對(duì)目標(biāo)酶的抑制而不是對(duì)耦聯(lián)酶的抑制。如果檢測(cè)樣品的組分可能會(huì)有明顯的干擾，研究者須要對(duì)特定步驟如（免疫）沉淀或部分純化進(jìn)行仔細(xì)考量以移除這些組分 [16] 。關(guān)鍵點(diǎn)是無論采取何種檢測(cè)手段，都要對(duì)潛在的干擾源提高警惕并設(shè)法清除或最小化它們可能帶來的影響。

重復(fù)性／穩(wěn)定性／準(zhǔn)確性 

為獲得可靠可用的數(shù)據(jù)檢測(cè)方法必須穩(wěn)定并可重復(fù)。檢測(cè)方法應(yīng)當(dāng)具有穩(wěn)定性，它不能受到樣品制備和處理過程中變化的過度影響。同樣的，不同個(gè)體進(jìn)行操作時(shí)它也應(yīng)當(dāng)能給出相同的結(jié)果。檢測(cè)方法也應(yīng)當(dāng)具備高重復(fù)性（也稱為準(zhǔn)確性），以保證實(shí)驗(yàn)內(nèi)和實(shí)驗(yàn)之間變異程度都盡可能小。在單次的檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)品和真實(shí)樣品的重復(fù)檢測(cè)應(yīng)當(dāng)給出非常接近的讀值。類似的，檢測(cè)讀值間因操作日期帶來的差異也應(yīng)當(dāng)很小。

如果檢測(cè)方法是為了測(cè)定特定成分的絕對(duì)含量（非相對(duì)含量），它應(yīng)當(dāng)以公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)（見上文）以便給出準(zhǔn)確的定量。滿足要求的穩(wěn)定性，可重復(fù)性和準(zhǔn)確性依賴于檢測(cè)的目的，因此必須由研究者根據(jù)自己的特定目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。

檢測(cè)方法效果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 

假設(shè)符合高斯分布，兩組結(jié)果之間的差值如果大于2SD（標(biāo)準(zhǔn)差）就被認(rèn)為在95%的置信區(qū)間上存在顯著性差異。類似的兩組結(jié)果之間的差值如果大于3SD（標(biāo)準(zhǔn)差）就被認(rèn)為在99.7%的置信區(qū)間上存在顯著性差異。因此，檢測(cè)方法的重復(fù)性（精度）越高，也就是說實(shí)驗(yàn)讀值的SD越低，檢測(cè)方法的區(qū)分度將越高。

圖 2. 檢測(cè)方法效果評(píng)估。

檢測(cè)方法的效果可通過多種不同的方式進(jìn)行分析。

信號(hào)背景比或是信號(hào)窗口（S/B=平均信號(hào)/平均背景）和信噪比（S/N=平均信號(hào)-平均背景/背景的SD值）常被用來分析檢測(cè)方法的效果。然而，這些比值無法充分考量檢測(cè)方法的變化性。一個(gè)簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，Z’值被開發(fā)出來通過同時(shí)考量信號(hào)窗口和檢測(cè)變化性以檢驗(yàn)檢測(cè)方法的質(zhì)量。Z'值越高（圖2），檢測(cè)方法的區(qū)分度越高，完美的檢測(cè)方法的Z’值為1.通常高通量檢測(cè)方法的Z’值只要>0.5便可。盡管Z'值檢驗(yàn)源自對(duì)HTS檢測(cè)方法的評(píng)估，它已成為檢測(cè)方法質(zhì)量評(píng)估的通用標(biāo)準(zhǔn)并可適用于各種檢測(cè)方法 [17] 。

無標(biāo)記檢測(cè)和藥物發(fā)現(xiàn)

在藥物發(fā)現(xiàn)研究中頻繁使用以自動(dòng)的方式進(jìn)行的高通量測(cè)定的熒光和發(fā)光標(biāo)記檢測(cè)方法。然而，隨著新技術(shù)的發(fā)展，對(duì)使用無標(biāo)記的利用生物物理檢測(cè)方法有越來越多的興趣 [18-20] 。現(xiàn)在市場(chǎng)上有許多無標(biāo)記檢測(cè)儀器 [18, 19] 。重要的是，無標(biāo)記測(cè)定法避免報(bào)告系統(tǒng)所造成的假象。例如，通常使用的生物發(fā)光性報(bào)告分子螢火蟲螢光素本身是GPR35的部分激動(dòng)劑 [21] ， 因此潛在地復(fù)雜化了化合物／藥理數(shù)據(jù)的解釋。無標(biāo)記檢測(cè)一個(gè)額外的好處是，它們?cè)试S在疾病相關(guān)的主要針對(duì)受體的內(nèi)源性表達(dá)水平的原細(xì)胞和干細(xì)胞進(jìn)行化合物的篩選 [20] 。 

意想不到的報(bào)道子-化合物相互作用也可能發(fā)生在生物化學(xué)測(cè)定（除了以上討論的淬火和自發(fā)熒光的問題）。例如，好幾個(gè)當(dāng)用TAMRA標(biāo)記的肽底物顯示活化SIRT1的蛋白脫乙酰酶活性的化合物在用未標(biāo)記的版本相同的肽的天然全長(zhǎng)蛋白底物酶測(cè)定中并無活性。用TAMRA標(biāo)記的底物所觀察到的活化是一種假象，是由于與TAMRA熒光團(tuán)的化合物的直接的物理相互作用 [22] 。

因此，在設(shè)計(jì)和驗(yàn)證用于篩選／化合物分析的目的時(shí)，必須考慮化合物和報(bào)道子-相互作用的可能性是非常重要的。應(yīng)慎重考慮使用無標(biāo)記檢測(cè)在篩選時(shí)的一些的潛在利益。