重組蛋白純化的基本原則

蛋白的分離純化是生物工程下游階段一個(gè)比較重要的部分，尤其在基因工程重組蛋白的分離純化中，上游過(guò)程的許多因素會(huì)直接影響到下游蛋白的分離，充分利用上游對(duì)下游的影響，對(duì)蛋白的純化做一個(gè)全面的考慮和整體的設(shè)計(jì)。是否帶有親和標(biāo)簽，His標(biāo)簽，GST標(biāo)簽等，不同的親和標(biāo)簽選擇不同的純化方案；可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對(duì)聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通常活性蛋白的得率比較低；是否對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性，從而選擇抗毒性的表達(dá)系統(tǒng)；怎樣選擇表達(dá)系統(tǒng)，是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)還是CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過(guò)程，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)；蛋白的化學(xué)性質(zhì)，是否容易被蛋白酶降解，是否會(huì)和一些金屬離子，化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)；蛋白的物理性質(zhì)，是否對(duì)溫度敏感等。從蛋白基因的獲取，蛋白基因的克隆，蛋白的表達(dá)，做好一個(gè)整體的規(guī)劃，將對(duì)純化工作的方便快捷高效帶來(lái)關(guān)鍵的影響。

基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記有很多，通過(guò)改變 cDNA在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個(gè)額外氨基酸，這個(gè)加入的標(biāo)記可用來(lái)作為一個(gè)有效的純化依據(jù)。GST融合載體，蛋白A融合載體，含組氨酸標(biāo)記（His-tagged）等，不同親和標(biāo)簽的蛋白有不同的純化方案。

選擇親和標(biāo)簽時(shí)注意的問(wèn)題

親和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響，又要考慮到對(duì)標(biāo)簽與其配體親和作用的影響，以及實(shí)際的用途。

幾種常規(guī)蛋白純化標(biāo)簽比較

（1）親和標(biāo)簽是否會(huì)影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，大多數(shù)情況首選短的多肽標(biāo)簽，這是因?yàn)槎痰碾臉?biāo)簽對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)影響最小，而大的親和標(biāo)簽可能限制重組蛋白的折疊，影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

（2）親和標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，親和標(biāo)簽的加入是否會(huì)影響到目標(biāo)蛋白的正確折疊，是促進(jìn)目標(biāo)蛋白的可溶性，還是容易形成包涵體，會(huì)不會(huì)造成氨基酸C和N端破壞，使目的蛋白表達(dá)不完全。

（3）親和標(biāo)簽所融合的位置，親和標(biāo)簽可以加在N端，可以加在C端，也進(jìn)行串聯(lián)。多數(shù)情況下蛋白質(zhì)的N端區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能不是太重要，所以在N端進(jìn)行融合標(biāo)簽的融合常常能保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。由于N端DNA序列對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯影響較大，所以標(biāo)簽加在N端對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平影響更大，優(yōu)化標(biāo)簽的mRNA結(jié)構(gòu)可使表達(dá)水平提高?？赡苡行┑鞍准兓笮枰コH和標(biāo)簽C端融合在去除融合標(biāo)簽后在目標(biāo)蛋白的C端會(huì)有幾個(gè)氨基酸殘留，而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N端親和標(biāo)簽后得到天然的目標(biāo)蛋白。

（4）親和洗脫的條件，有些條件比較溫和，而有些條件較為劇烈，選擇的親和表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該不使目標(biāo)蛋白變性。

常用親和標(biāo)簽

HIS標(biāo)簽

His標(biāo)簽是當(dāng)前最為熱門(mén)的標(biāo)簽蛋白之一。His6是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當(dāng)某一個(gè)標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測(cè)；二是構(gòu)成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。

Flag-tag

Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。

AviTag

是一個(gè)15個(gè)氨基酸的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端。融合表達(dá)后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。

SNAP-Tag 

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。SNAP所帶的活性巰基位點(diǎn)接受了苯甲基鳥(niǎo)嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)，釋放出了鳥(niǎo)嘌呤。這種新的硫醚鍵共價(jià)結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo)記物。 

檢測(cè)：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進(jìn)入細(xì)胞，方便快捷地進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)SNAP-Tag融合蛋白的標(biāo)記與檢測(cè)。它們也可特異性地標(biāo)記大腸桿菌，酵母和哺乳動(dòng)物等細(xì)胞抽提液或已經(jīng)純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 

GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）

GST標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測(cè)。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。

純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。

如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。

GFP

GFP（綠色螢光蛋白）是由下村修等人在水母中發(fā)現(xiàn)的。它在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光。GFP標(biāo)簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，相應(yīng)的GFP標(biāo)簽抗體也被廣泛應(yīng)用。GFP在檢測(cè)蛋白表達(dá)、蛋白和細(xì)胞熒光示蹤、研究蛋白質(zhì)之間相互作用和構(gòu)象變化中，起到了重要的作用。

常規(guī)化的c-Myc

C-Myc標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含11個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，它作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中可識(shí)別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中，可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。

 熒光素酶（luciferase）:

來(lái)源于生物體內(nèi)的熒光素，常見(jiàn)的有螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報(bào)告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測(cè)法或螢光素酶檢測(cè)法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標(biāo)簽不同，使用熒光素酶構(gòu)建的報(bào)告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動(dòng)子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調(diào)控，因?yàn)樗鼈儗?duì)目的基因的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡(jiǎn)單的開(kāi)和關(guān)兩種狀態(tài)。

廣泛使用的融合標(biāo)簽的分子量比較（來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

如何選則重組蛋白表達(dá)時(shí)的標(biāo)簽

1、首先，需要確定融合標(biāo)簽的目的

蛋白純化 ：標(biāo)簽的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHis Tag常被用于細(xì)胞內(nèi)源蛋白的純化。6XHis Tag也廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的蛋白純化?？墒遣溉閯?dòng)物細(xì)胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景，因此極少使用6XHis Tag。

Western Blot檢測(cè)：若需要做Western Blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞裂解物中蛋白的表達(dá)，你可以選擇有匹配的抗體的小分子標(biāo)簽。FLAG Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業(yè)化的抗體等優(yōu)勢(shì)，成為Western Blot實(shí)驗(yàn)中常用的Tag。

免疫沉淀反應(yīng)：FLAG Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業(yè)用抗體等優(yōu)勢(shì)成為免疫沉淀反應(yīng)中最常用的Tag. 其他常用的標(biāo)簽有：HA和cMyc.

活細(xì)胞成像：熒光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活細(xì)胞成像常用的標(biāo)記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些紅色變體，如dTomato和mCherry.

2、考慮融合標(biāo)簽的影響

任何一類標(biāo)簽處于氨基酸序列的任一位置，都具有影響目的蛋白表達(dá)或功能的可能性。最主要原因是標(biāo)簽可能會(huì)干擾蛋白的正確折疊，致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次，標(biāo)簽可能會(huì)中斷亞細(xì)胞定位信號(hào)，這種情況下，蛋白能夠正確翻譯和折疊，但在細(xì)胞內(nèi)所處的位置是錯(cuò)誤的。因此，您需要知道添加的標(biāo)簽對(duì)目的蛋白的表達(dá)是否有影響。

3、考慮是在N-端還是C-端標(biāo)記

N-端或C-端標(biāo)記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、定位等特性。然而，倘若你沒(méi)有確切的蛋白結(jié)構(gòu)，或蛋白功能域圖譜，建議分別構(gòu)建N-端標(biāo)記和C-端標(biāo)記的表達(dá)克隆，以檢測(cè)哪個(gè)更有效。

樣品的預(yù)處理

1.誘導(dǎo)方式:

誘導(dǎo)方式的選擇上，為了得到正確折疊的目的蛋白，表達(dá)菌種的生長(zhǎng)情況，菌種是否健壯，是否是單克隆菌種，菌體的濃度是否適合誘導(dǎo)，生長(zhǎng)狀態(tài)不好的表達(dá)菌，一方面會(huì)造成目的蛋白的錯(cuò)誤折疊，造成蛋白大小，形態(tài)等發(fā)生改變，另一方面會(huì)因?yàn)镮PTG的加入，導(dǎo)致菌體的死亡或者降解。

低溫度誘導(dǎo)有助于蛋白二硫鍵的正確折疊，但對(duì)于高溫表達(dá)的蛋白不適合低溫狀態(tài)，溫度過(guò)高容易導(dǎo)致包涵體的形成。

2.誘導(dǎo)劑：

基因的誘導(dǎo)表達(dá)基于乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制，沒(méi)有乳糖存在的時(shí)候，阻礙物基因產(chǎn)生阻礙蛋白，阻礙蛋白和操縱子結(jié)合，抑制基因的表達(dá)；當(dāng)有乳糖存在的時(shí)候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用產(chǎn)生異半乳糖，異半乳糖和阻礙蛋白結(jié)合，解除抑制，激活基因，開(kāi)始表達(dá)蛋白。誘導(dǎo)的濃度的高低對(duì)目的蛋白的表達(dá)也會(huì)有產(chǎn)生影響。BL21（DE3）, Rosetta(DE3)等大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)這些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌體DE3。DE3是的一種衍生λ噬菌體，帶有噬菌體21抗性區(qū)和 lacI基因，lacUV5啟動(dòng)子，以及 T7 RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒(méi)有輔助噬菌體時(shí)整合到染色體上或從染色體切出。一旦形成DE3溶原狀態(tài)，就只有受IPTG誘導(dǎo)的lacUV5啟動(dòng)子指導(dǎo)T7 RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，在溶原培養(yǎng)體系中加入IPTG誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶生產(chǎn)，繼而質(zhì)粒上的目的DNA開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。

3.收獲方式：

進(jìn)行破壁之前應(yīng)該選擇合適的緩沖組分， 合適的pH 要結(jié)合酸堿溶液的滴定調(diào)節(jié)，盡量低的離子強(qiáng)度 ，加入一些穩(wěn)定成分穩(wěn)定成分，EDTA螯合重金屬離子，Triton X-100，NP40等表面活性劑，保護(hù)非極性表面等。

4.確定蛋白質(zhì)樣品的形態(tài)，濃度 黏度 體積。

有時(shí)候得到粗蛋白的時(shí)候，會(huì)觀是否符合目的蛋白的一些性質(zhì)，確保得到是目標(biāo)蛋白。粗蛋白的形態(tài)有沒(méi)有明顯的差異，濃度是否符合純化的要求，是否有較多的干擾物質(zhì)，核酸 色素 強(qiáng)結(jié)合成分。

5.優(yōu)化表達(dá)條件

（1）重組蛋白不表達(dá)或者表達(dá)量低。如果重組蛋白不表達(dá)（包含體和可溶蛋白都沒(méi)有）通過(guò)改變誘導(dǎo)劑濃度，誘導(dǎo)溫度，時(shí)間等都不表達(dá)的時(shí)候，然后嘗試更換菌株、質(zhì)粒載體。

降低誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度。重組蛋白表達(dá)得越慢，其折疊效果就越好，大腸桿菌在4℃時(shí)依然可以表達(dá)重組蛋白，而將培養(yǎng)溫度降低至25-30℃就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)；

減少誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑濃度可以降低至1/10；選用Lac滲透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。這類菌株能夠使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的誘導(dǎo)劑濃度相同。重組蛋白在所有細(xì)胞中的表達(dá)水平相當(dāng)時(shí)，減少誘導(dǎo)劑的效果更好。

（2）檢查密碼子構(gòu)成，使其適應(yīng)宿主菌的密碼子偏好。稀有密碼子，尤其是位于重組蛋白N端的和大量集中的稀有密碼子，會(huì)降低mRNA穩(wěn)定性，顯著降低翻譯速度，引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。將這些稀有密碼子（尤其是N端?。┩蛔?yōu)樗拗髌玫拿艽a子，能夠顯著提高表達(dá)水平。改善蛋白穩(wěn)定性。能夠引起蛋白降解的因素很多，從蛋白自身性質(zhì)到宿主性質(zhì)不一而足，如果重組蛋白在表達(dá)時(shí)就被降解，表達(dá)量和穩(wěn)定性就會(huì)受到很大影響。在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白，需要牢記N端法則：當(dāng)N端第二個(gè)殘基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp時(shí)，重組蛋白半衰期只有2分鐘，而小側(cè)鏈的氨基酸殘基，如Ala，則可以提高蛋白穩(wěn)定性。因此在設(shè)計(jì)載體時(shí)，要特別注意第二個(gè)密碼子，避免上述殘基的出現(xiàn)。

處理高毒性蛋白：毒性極高的重組蛋白，其本底表達(dá)就會(huì)殺死原核宿主，質(zhì)粒容易丟失，使其在大腸桿菌中很難得到高表達(dá)。采用可表達(dá)T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制劑，采用含有T7溶菌酶質(zhì)粒的宿主，如pLysS，可以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長(zhǎng)期的本底表達(dá)量，在受到IPTG誘導(dǎo)時(shí)也能較好的表達(dá)蛋白。

（3）包涵體表達(dá)：包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對(duì)混亂、沒(méi)有生物活性、變復(fù)性條件需要長(zhǎng)時(shí)間摸索等，即使包涵體蛋白成功復(fù)性，其均一性和活性依然備受質(zhì)疑。但是包涵體表達(dá)也有其優(yōu)勢(shì)：能夠很輕松的獲得超高的表達(dá)量，不可溶的重組蛋白不會(huì)被宿主內(nèi)的蛋白酶降解，重組蛋白的毒性被大大抑制，雜蛋白含量低（~10%），容易純化等。由于這些優(yōu)點(diǎn)以及蛋白質(zhì)復(fù)性條件的不斷發(fā)展，表達(dá)包涵體蛋白逐漸為人們所接受，成為重組蛋白表達(dá)的一個(gè)常用方案。與可溶蛋白相反，提高培養(yǎng)溫度、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、在較高的菌密度下誘導(dǎo)都有利于包涵體的形成；在破菌和變性溶解時(shí)加入還原劑能夠打開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵；在復(fù)性液中加入二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶、分子伴侶和蛋白的輔助因子可以幫助重組蛋白折疊；精氨酸和高分子量PEG能減輕蛋白分子的聚集；嘗試多種物理手段，如透析、快速稀釋和柱上復(fù)性等，有時(shí)對(duì)復(fù)性有奇效。包涵體的表達(dá)相對(duì)簡(jiǎn)單，但其復(fù)性過(guò)程仍是依賴經(jīng)驗(yàn)的，沒(méi)有通用的方法可以套用。