Q:包涵體使用透析方式進(jìn)行復(fù)性，蛋白濃度，復(fù)性液以及復(fù)性溫度如何研究？

A:我們都是稀釋復(fù)性的，工業(yè)上復(fù)性主要是稀釋法。

Q:也嘗試了稀釋復(fù)性，但是蛋白都以聚集沉淀除去了，你們的復(fù)性液一般是什么？

我采用的復(fù)性液：50 mM Tris-HCl，0.05%聚乙二醇(PEG)4000，5%甘油，0.1mM EDTA，100mMNaCl，0.01mM GSSG，pH8.0-8.5；將變性蛋白質(zhì)稀釋15-60倍，使變性劑濃度降低至蛋白質(zhì)可以進(jìn)行重折疊的程度，即緩慢的將變性包涵體蛋白滴加至燒杯折疊緩沖液中，同時(shí)劇烈攪拌以快速混勻。稀釋過程在室溫下進(jìn)行，混合完成后，將溶液靜置1-2小時(shí)以保證重折疊過程的完成，同時(shí)也使聚集物形成并出現(xiàn)絮凝物。

A: 我們沒有PEG和甘油，具體的參數(shù)還得自己摸索。

Q:處理方式是這樣嗎？

A:透析復(fù)性也不適合工業(yè)放大啊，只能實(shí)驗(yàn)室搞搞。

Q:稀釋一般情況下終濃度保持在1-10ug/ml，對蛋白的回收率也是一種挑戰(zhàn)。無論是哪種方法，感覺這就是一門學(xué)問，成功的概率存在偶然性。

A:正確復(fù)性的如大海撈針。要不斷優(yōu)化，比如稀釋法，緩沖液種類，離子強(qiáng)度，pH，添加劑，及添加量，滴加方式，攪拌速度，要系統(tǒng)得做試驗(yàn)優(yōu)化。做個(gè)DOE。

Q:包涵體或者分泌表達(dá)的層析方法大家可以分享交流一下。目前對這塊兒比較感興趣。

A:好多年前的經(jīng)驗(yàn)了：稀釋復(fù)性是最經(jīng)典的效果最好；氧化還原對和分子伴侶在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模都還可以，不過不一定適合放大；透析損失是最大的；

柱上復(fù)性做研究可以，但工業(yè)上用的非常少，可能缺少工業(yè)成功案例，大家可以試試看，實(shí)驗(yàn)室即使做成功了，也面臨著放大過程的很多問題。

Q:變性蛋白所處環(huán)境若發(fā)生突變，即短時(shí)間內(nèi)變性劑濃度的大幅度變化，會(huì)迫使蛋白在短時(shí)間內(nèi)形成更緊湊的結(jié)構(gòu)，容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，那么這和稀釋復(fù)性是存在矛盾的？

A:有交集不矛盾。稀釋復(fù)性，也可以嘗試將復(fù)性液分階段緩慢的加入到變性的蛋白溶液中，不劇烈，比如總稀釋50倍，可以先加5倍體積，停止一段時(shí)間在加5倍體積。

Q:參考蛋白質(zhì)純化指南（美 R.R. 伯吉斯)通過稀釋復(fù)性之后0.22μm的濾膜過濾重折疊蛋白質(zhì)，然后將其上柱（SP離子交換層析柱），竟然不與柱料結(jié)合，但是我的天然蛋白是結(jié)合的，也是無解。

A:做的是哪類的產(chǎn)品。還要注意一個(gè)問題，復(fù)性后蛋白的用途，生物醫(yī)藥和其它用途的蛋白對各種添加劑及各種物質(zhì)限量的要求是完全不一樣的。

Q:還有更奇怪的，偶然的一次通過透析復(fù)性搞出了活性，但是再重復(fù)就做不出來了，無比的奇怪。

A:GSH／GSSG這兩個(gè)有沒有考慮添加，它們的配比是不是可以優(yōu)化優(yōu)化。

Q:這個(gè)我也嘗試了GSH／GSSG，沒有搞出活性，我的感覺是越做越迷茫。

A:包涵體復(fù)性是非常復(fù)雜的過程，要系統(tǒng)性的優(yōu)化。

Q:嘗試了精氨酸，PEG，甘油等，無功而返。

A:濃度高也會(huì)影響。我這邊就是高濃度出現(xiàn)聚集。。。濃度，表面活性劑都還在考慮。還有個(gè)問題，復(fù)性效率的監(jiān)測。。PAGE是個(gè)方式。但是效率慢。目前濃度略低。。。還在摸索中。