慢病毒

圖1：慢病毒作用機(jī)制（來(lái)源和元生物）

慢病毒的英文是Lentivirus，它的命名有兩層意思，一方面Lenti-在拉丁文中有慢的意思；另一方面慢病毒感染患者早期很難觀察，大多都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后會(huì)緩慢發(fā)病，因此這些病原微生物被稱(chēng)之為慢病毒。它是逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個(gè)屬，其主要包括8種能夠感染人和脊椎動(dòng)物的病毒，原發(fā)感染的細(xì)胞以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，最終導(dǎo)致感染個(gè)體發(fā)病。慢病毒的基因組都很復(fù)雜，編碼一系列不同于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)控蛋白，這使得它們具有獨(dú)特的調(diào)控途徑和病毒持久性機(jī)制。

逆轉(zhuǎn)錄病毒家族包括致癌病毒（RNA腫瘤病毒）、狼瘡病毒以及慢病毒，這三個(gè)子家族的成員都能感染人類(lèi)。慢病毒通常與免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病有關(guān)，如人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）會(huì)導(dǎo)致艾滋病，HTLV和HIV會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)障礙。

1904年第一個(gè)慢病毒被分離出來(lái)的，它是從一匹得了溶血性貧血的馬中得到，所以被命名為馬傳染性貧血病毒（EIAV）。從那時(shí)起，相關(guān)的慢病毒陸續(xù)從其他的物種中被分離，如猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及靈長(zhǎng)類(lèi)免疫缺陷病毒（SIV）等。

慢病毒常規(guī)應(yīng)用

慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類(lèi)型原代細(xì)胞和大部分細(xì)胞系。

慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，因而可以達(dá)到持久性表達(dá)，從而構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，體外進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等研究。穩(wěn)定表達(dá)目的基因的腫瘤細(xì)胞株還可以進(jìn)一步構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型，進(jìn)行體內(nèi)基因功能驗(yàn)證，藥效藥代，活體成像等檢測(cè)，進(jìn)一步研究體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移及藥物治療的效果。

MOI 是multiplicity of infection 的縮寫(xiě)，即感染復(fù)數(shù)，其含義是感染時(shí)病毒與細(xì)胞的數(shù)量比值，一般以實(shí)驗(yàn)中某個(gè)細(xì)胞，感染達(dá)到80%，定義為這個(gè)細(xì)胞的MOI值，即病毒量與細(xì)胞數(shù)的比值；加的病毒量(μl)=細(xì)胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000（注：本段內(nèi)容選自和元生物管網(wǎng)）

慢病毒的理化性質(zhì)

慢病毒雖然屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一種，但其結(jié)構(gòu)和基因組的復(fù)雜程度遠(yuǎn)超其他逆轉(zhuǎn)錄病毒。這也使得慢病毒具有獨(dú)特的整合機(jī)制和病毒感染持久性。

慢病毒整體大小約100nm，在病毒載體中屬于體積較大類(lèi)型。其包裝容量一般在4.5-5kb左右，能夠滿足一般的細(xì)胞治療需求。

慢病毒檢測(cè)方法

在293T細(xì)胞株中對(duì)純化的慢病毒進(jìn)行滴度測(cè)定，常用有4種方法進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定，分別是： 

?通過(guò)ELISA對(duì)病毒顆粒中的p24蛋白進(jìn)行檢測(cè); ?通過(guò)定量PCR對(duì)病毒顆粒的RNA進(jìn)行檢查;

?通過(guò)定量PCR對(duì)整合到基因組DNA中的病毒序列進(jìn)行檢測(cè)；

?通過(guò)FACS對(duì)熒光蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

但前兩種方法并不能區(qū)分病毒顆粒是否有活性，因此測(cè)定所得的滴度往往比后兩種方法高一至兩個(gè)數(shù)量級(jí)。后兩種方法測(cè)定的是有效的病毒滴度，因此更有意義。由于并非所有的病毒載體中都含有熒光蛋白，此外，熒光蛋白的表達(dá)有時(shí)候還受啟動(dòng)子及表達(dá)的目的基因影響，因此過(guò)定量PCR對(duì)整合到基因組DNA中的病毒序列進(jìn)行檢測(cè)是最佳方法。

慢病毒下游工藝解決方案

1.澄清的病毒溶液經(jīng)核酸酶孵育，核酸酶將宿主細(xì)胞核酸講降解成小片段，且降低粘度。

2.核酸酶處理后的病毒溶液用300-750KD的膜組件進(jìn)行切向流過(guò)濾伴隨置換緩沖液，調(diào)整病毒粒子的濃度且使病毒溶液適用于下游分離純化。

3.用Seplife Suncore 700多模式層析介質(zhì)進(jìn)行粗純，小于700KD的HCP,HCD，培養(yǎng)基組分等物質(zhì)進(jìn)入多模式介質(zhì)的活性?xún)?nèi)核區(qū)域，和介質(zhì)以靜電力，疏水作用，范德華力等結(jié)合，而慢病毒由于分子尺寸大，被排阻在介質(zhì)的惰性層以外流穿而過(guò)，從而實(shí)現(xiàn)分離。

4.經(jīng)多模式層析粗純后，痕量的雜質(zhì)可以用高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質(zhì)Q Large Scale或者大孔（孔徑約400nm) 離子交換介質(zhì) Seplife LX-Q400超大分子專(zhuān)用離子交換介質(zhì)吸附洗脫模式純化。同時(shí)也可用凝膠過(guò)濾層析Seplife 4FF流穿模式去除痕量的雜質(zhì)。

5.層析純化后，在經(jīng)超濾過(guò)程調(diào)整病毒粒子濃度及置換后續(xù)工序適合的緩沖液。

6.最后用0.22um的膜組件除菌過(guò)濾。更多關(guān)于慢病毒下游工藝解決方案的信息請(qǐng)聯(lián)系蘇州藍(lán)曉生物。

注意事項(xiàng)：

每一步工序后，在開(kāi)始下一步工序都要考慮病毒粒子濃度及緩沖液體系的匹配性，必要的情況下都要進(jìn)行超濾過(guò)程調(diào)整病毒粒子濃度及置換緩沖液。

層析過(guò)程中，體系pH7.0-9.0更利于HCP和多模式及陰離子交換介質(zhì)的結(jié)合。