Vero細胞

Vero胞(非洲綠猴腎細胞)是日本學(xué)者Yasumura和Kawakita兩人在1962年正式從非洲綠猴腎臟分離的，初次用于生產(chǎn)人用生物制品的異倍體貼附依賴性細胞，并建立了細胞系和不同代次的細胞庫。在此之前，對生物制品的研究和生產(chǎn)只允許用原代細胞或二倍體細胞。

近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已從簡單的試驗研究拓展到了生物學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。生物制品如病毒性疫苗、醫(yī)學(xué)治療性抗體的研究與生產(chǎn)都用到了細胞培養(yǎng)技術(shù)。

Vero細胞在病毒類生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用

?新冠病毒滅活疫苗

?狂犬病毒滅活疫苗

?輪狀病毒疫苗

?流行性乙型腦炎病毒疫苗

?腸道病毒 71 型疫苗

?脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(IPV)

?口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)

1987年，WHO才正式批準(zhǔn)傳代細胞系作為生物制品生產(chǎn)的基質(zhì)。Vero細胞被批準(zhǔn)用于人用疫苗的生產(chǎn)后，開始生產(chǎn)的人用疫苗是Barrett等生產(chǎn)的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(IPV)，之后Vero細胞用于狂犬病毒疫苗和口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)等多種人用疫苗生產(chǎn)。Vero細胞在病毒性疫苗生產(chǎn)的應(yīng)用已有30年之久，尤其是狂犬病毒疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。

Vero細胞的優(yōu)勢

?容易建立細胞庫和保存，可連續(xù)傳代，生長速度快；

?Vero 細胞遺傳性狀穩(wěn)定，惡性化概率小，無外源性污染，具有良好的生物安全特性；

?Vero 細胞對多種病毒敏感，生產(chǎn)的病毒滴度高；

?Vero 細胞對培養(yǎng)條件要求不高，在微載體表面能良好的貼附生長，易在生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)。

大規(guī)模反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細胞

馴化Vero細胞適應(yīng)在用于大規(guī)模生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基內(nèi)生長。帶有詳細傳代記錄的Vero細胞凍存管被復(fù)蘇；并傳代到T形瓶和滾瓶中，生產(chǎn)出足夠數(shù)量的細胞以接種Seplife LX-MC-dex1微載體生物反應(yīng)器。細胞匯合后， 細胞按照大約1:7的比例傳代到后面的生物反 應(yīng)器。最終的細胞密度在2-3×106/ml。

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易。將對細胞無害的微載體顆粒加入培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長和擴增三個階段。細胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，因此細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關(guān)鍵。細胞主要通過靜電引力和范德華力與微載體黏附，這取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

圖片來源：科興中維生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的vero細胞顯微鏡下觀察的照片_百度圖片搜索 (baidu.com)

藍曉科技的微載體廣泛應(yīng)用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，藍曉科技自主研發(fā)的Seplife LX-MC-dex1細胞培養(yǎng)微載體在Vero細胞、CHO細胞、293T細胞及MDCK細胞等已廣泛用于生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，細胞可貼附微球 2D 表面生長，1g的Seplife LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細胞貼附。

Seplife LX-MC-dex1技術(shù)參數(shù)

細胞生長曲線

Vero細胞在兩家不同批次微載體的培養(yǎng)基中，24h至96h細胞生長曲線如圖1所示。

圖1：藍曉科技細胞培養(yǎng)微載體和進口微載體用于Vero細胞培養(yǎng)生長曲線

細胞生長情況觀察

圖2：藍曉科技細胞培養(yǎng)微載體用于Vero細胞培養(yǎng)細胞生長情況觀察

Seplife LX-MC-dex1微載體的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，基于微載體生產(chǎn)的疫苗除了新冠以外，還包括脊髓灰質(zhì)炎、風(fēng)疹、狂犬病、流感、日本腦炎（乙型腦炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。與其他細胞培養(yǎng)工藝相比，微載體培養(yǎng)工藝可以提高產(chǎn)量，降低成本，并減少污染。

Seplife LX-MC-dex1微載體使用方法

1.微載體預(yù)處理

首先，干燥的微載體在無 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸緩沖液（PBS pH=7.4，每克微載體加50-100ml）中在室溫下浸泡膨脹至少 3 小時。然后，棄去上清液，用新配制的無 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微載體加30-50ml）洗滌微載體數(shù)分鐘。接著，棄去 PBS，換上新的無 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微載體加 30-50ml）。之后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15min，15psi）。微載體Seplife LX-MC-dex1 非常穩(wěn)定，可以反復(fù)（至少5次）長時間 （130°C，12h，27psi）進行高壓滅菌而不影響其性能。滅菌結(jié)束后使用前，加入培養(yǎng)基潤洗置換（20-50ml/g），之后加入 10%血清或無血清培養(yǎng)基放置過夜。

2.微載體培養(yǎng) 

準(zhǔn)備好消化好的細胞，連同之前準(zhǔn)備好的微載體一起加入方瓶或反應(yīng)器中（微載體加量 1-5g/L），在一定條件下開始培養(yǎng)，4 小時后觀察細胞貼附情況。如果細胞貼附良好，繼續(xù)跟蹤培養(yǎng)，觀察細胞生長情況。

3 微載體培養(yǎng)操作要點 

（1）培養(yǎng)初期：

保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的 pH 與溫度水平，接種細胞（對數(shù)生長期， 而非穩(wěn)定期）至終體積 1/3 的培養(yǎng)液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。常使用 2-3g/L 的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時攪時停；數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時， 維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度 75r/min。 

（2）貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì) 混合。 

（3）培養(yǎng)維持期：進行細胞計數(shù)（胞核計數(shù)）、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢。隨著細胞增 殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過 3d 左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液。具體方 法：停止攪拌，讓微珠沉淀 5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重 新開始攪拌。

（4）收獲細胞：首先，排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗 1 遍；然后，加入相應(yīng)的酶，快速 攪拌（75-125r/min）20-30min；最后，解離收集細胞及其產(chǎn)品。 

（5）微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行放大。使用異倍體或 原代細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至 4000L 以上。

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