概論

現(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。下面我們盤點(diǎn)一下細(xì)胞復(fù)蘇、傳代到凍存的步驟和經(jīng)驗(yàn)，希望對(duì)廣大科研工作者有所幫助。

細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶”，復(fù)蘇時(shí)一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細(xì)胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

復(fù)蘇準(zhǔn)備

?打開(kāi)水浴鍋加熱至37℃。

? 超凈臺(tái)上放好離心管（一般15ml的），細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風(fēng)5至10分鐘除去臭氧。

?37℃預(yù)熱好要復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)液，也可以不用預(yù)熱培養(yǎng)液，根據(jù)細(xì)胞情況選擇。

?向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液，從液氮罐或-80℃中取出凍存細(xì)胞，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動(dòng)，待融化后（約2min即可）立即將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中，800-1000rpm下離心5min，棄上清，加適量完全培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕晃使瓶底液體分散均勻，標(biāo)好細(xì)胞名稱、代數(shù)、復(fù)蘇日期，顯微鏡下觀察后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細(xì)胞過(guò)夜即可貼壁，換液和傳代時(shí)間根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。

細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

?復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作要快，盡量減少胞內(nèi)形成冰晶，影響復(fù)蘇后細(xì)胞活率。

? 融化時(shí)盡量不要碰到管口，以免容易造成污染。

?若一次性需要復(fù)蘇細(xì)胞很多，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細(xì)胞融化時(shí)間延長(zhǎng)。

?若需要同時(shí)復(fù)蘇好幾種細(xì)胞，提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，或記住自己擺放的位置，不要弄混亂。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

懸浮細(xì)胞傳代

待培養(yǎng)液中酚紅指示劑變黃，在已紫外滅菌后的超凈臺(tái)上吸出或倒出細(xì)胞懸液至離心管中（根據(jù)細(xì)胞液的量選擇15ml或50ml離心管），800-1000rpm下離心5min，棄去營(yíng)養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)液，加預(yù)熱好的完全培養(yǎng)液適量，輕輕吹打重懸細(xì)胞后，吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，或直接取適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)加一定量新鮮完全培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，有些脆弱的細(xì)胞用自然沉降法沉降細(xì)胞，吸去上面舊培養(yǎng)液加入新的完全培養(yǎng)液后吹散進(jìn)行傳代。傳代接種的細(xì)胞密度根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，一般間隔1-2天即可傳代一次。

細(xì)胞微載體培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的微載體顆粒加入培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)增三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，因此細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。細(xì)胞主要通過(guò)靜電引力和范德華力與微載體黏附，這取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

藍(lán)曉科技的微載體廣泛應(yīng)用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，藍(lán)曉科技自主研發(fā)的Seplife LX-MC-dex1細(xì)胞培養(yǎng)微載體在Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293T細(xì)胞及MDCK細(xì)胞等已廣泛用于生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，細(xì)胞可貼附微球 2D 表面生長(zhǎng)，1g的Seplife LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細(xì)胞貼附。

Seplife LX-MC-dex1技術(shù)參數(shù)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖1：藍(lán)曉科技細(xì)胞培養(yǎng)微載體和進(jìn)口微載體用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察

圖2：藍(lán)曉科技細(xì)胞培養(yǎng)微載體用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察

Seplife LX-MC-dex1微載體的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，基于微載體生產(chǎn)的疫苗除了新冠以外，還包括脊髓灰質(zhì)炎、風(fēng)疹、狂犬病、流感、日本腦炎（乙型腦炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。與其他細(xì)胞培養(yǎng)工藝相比，微載體培養(yǎng)工藝可以提高產(chǎn)量，降低成本，并減少污染。

貼壁細(xì)胞傳代

待培養(yǎng)瓶底中細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%-80%時(shí)，在經(jīng)紫外滅菌后的超凈臺(tái)上，棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)菌1*PBS洗滌瓶底細(xì)胞1-2次，用1ml（T25培養(yǎng)瓶）或2ml（T75培養(yǎng)瓶）trypsin溶液37℃下作用細(xì)胞，待顯微鏡下細(xì)胞回縮變圓，少部分細(xì)胞出現(xiàn)流沙狀時(shí)，快速吸去trypsin溶液，加預(yù)熱好的新鮮完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落且分散均勻，直接吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，或800-1000rpm下離心去上清，加適量新鮮完全培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中，再加入一定量完全培養(yǎng)液，搖勻瓶底細(xì)胞液后進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)

?吹打時(shí)每次不要排完移液管中液體，同時(shí)控制吹打節(jié)奏，這樣不容易吹出泡沫，泡沫對(duì)細(xì)胞有損傷作用，而且很難再顯微鏡下觀察清楚有沒(méi)有完全吧細(xì)胞吹打下來(lái)。

?不要等到貼壁細(xì)胞完全鋪滿瓶底，要留有一定空隙時(shí)細(xì)胞狀態(tài)才良好。

?消化時(shí)最好不要等到細(xì)胞成片飄起，否則細(xì)胞狀態(tài)受影響且第二天培養(yǎng)中死細(xì)胞較多。

細(xì)胞凍存

凍存的細(xì)胞要處在指數(shù)生長(zhǎng)期。懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞經(jīng)離心后用凍存液重懸，計(jì)數(shù)，凍存的細(xì)胞密度一般3*106-1*107 cells/ml，最好不少于1*106 cells/ml，否則復(fù)蘇后難以養(yǎng)起來(lái)，將重懸計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液以1-1.5ml快速分裝至各凍存管中，迅速擰緊蓋子，放入梯度凍存盒然后置于-80℃過(guò)夜，也可以先4℃放置30分鐘，再-20℃放置1-2小時(shí)，最后-80℃過(guò)夜（16-18小時(shí)），若梯度凍存盒不夠或無(wú)凍存盒，可以將凍存管置于泡沫盒中，用棉花包起來(lái)，棉花厚度約1cm，置于-80℃過(guò)夜，第二天取出-80℃細(xì)胞存放至液氮罐中，并在記錄好存放位置信息。

凍存準(zhǔn)備

?配制好凍存液。一般凍存液為培養(yǎng)液，血清，DMSO按照7:2:1的比例配制，也可以血清和DMSO按照9:1配制，不管哪種凍存液配制，血清多多益善，但DMSO都不可以多，以免對(duì)細(xì)胞造成損傷。

?準(zhǔn)備好凍存管，標(biāo)上細(xì)胞名稱，代次，凍存批號(hào)，凍存日期。

?準(zhǔn)備好細(xì)胞程序降溫盒或凍存用的材料，程序降溫盒放置室溫后使用。

細(xì)胞凍存注意事項(xiàng)

?程序降溫盒有無(wú)需有毒異丙醇填充的，有利于實(shí)驗(yàn)人員身體健康。

?DMSO有毒且皮膚會(huì)吸收，做好防護(hù)措施。DMSO本身不長(zhǎng)菌，不需要做滅菌處理。

?由-80℃轉(zhuǎn)至液氮時(shí)迅速，避免溫度上升影響細(xì)胞活性。

?每個(gè)凍存管不要加入體積太多，以免凍存時(shí)凝固體積膨脹，撐開(kāi)凍存管，且在下次復(fù)蘇時(shí)，融化較慢，導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞存活率不高。