腺病毒載體類生物制品下游工藝解決方案

2021-12-17 20:11:26

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腺病毒載體新冠疫苗代表企業(yè)

康希諾生物股份公司

廣州恩寶生物醫(yī)藥科技有限公司

北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司

江蘇省疾病預防控制中心

腺病毒載體新冠疫苗制備工藝

簡單來說，就是把腺病毒中原有與復制相關的基因剔除，替換為新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）的基因。這樣做的目的是使重新組裝的病毒復制新冠病毒刺突蛋白，從而刺激我們的免疫系統(tǒng)啟動免疫應答，產生免疫記憶。

圖1：腺病毒載體新冠疫苗技術（來源：康希諾生物 CanSinoBIO (cansinotech.com.cn)）

腺病毒載體新冠疫苗技術詳解：

? 作為載體的人5型腺病毒剔除了復制相關基因，在人體內不會復制；

? 在被剔除基因的位置上，插入新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的基因；

? 腺病毒載體攜帶S基因進入人體細胞；

? S基因進入人體細胞后合成S蛋白，作為抗原激發(fā)機體產生免疫應答。（來源：康希諾生物 CanSinoBIO (cansinotech.com.cn)

圖2：腺病毒載體新冠疫苗制備工藝（來源：網(wǎng)絡）

腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案

1.細胞培養(yǎng)：用蘇州藍曉生物科技的Seplife? LX-MC-dex1微載體培養(yǎng)HEK293SF細胞。微載體培養(yǎng)是目前公認最具發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，且容易放大。藍曉科技的微載體廣泛應用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規(guī)模生產中，藍曉科技自主研發(fā)的Seplife? LX-MC-dex1細胞培養(yǎng)微載體幾乎適合所有貼壁細胞（如Vero、CHO、293T及MDCK等），細胞可貼附微球 2D 表面生長，1g的Seplife? LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細胞貼附。

圖3：Seplife? LX-MC-dex1細胞培養(yǎng)微載體培養(yǎng)效果（來源：藍曉科技）

2.固液分離：細胞培養(yǎng)后，先經(jīng)過離心的方式固液分離去除培養(yǎng)基中水及培養(yǎng)基組分中的物質；

3.細胞洗滌：固液分離后收集細胞，可以用生理鹽水重懸細胞，對細胞進行洗滌（工業(yè)上此工序可省略），保持細胞破碎時破碎的是純凈的細胞；

4.細胞重懸：細胞洗滌后，重懸細胞，重懸細胞要注意重懸緩沖液的種類及和重懸后的細胞濃度，濃度影響后面破碎效率，緩沖液影響后續(xù)純化過程，盡量保持和下游工藝的合理銜接，避免置換緩沖液；

5.細胞破碎：重懸后可以用去污劑Tween20.Tween80.Triton X-100等破碎細胞，或者通過凍融的方式破碎細胞，破碎后可以測定病毒滴度，保證病毒全部釋放出來；

6.破碎液固液分離：破碎后再次離心固液分離，收集上清；

7.破碎上清液澄清：上清液在用微濾（GF）的方式進行澄清處理（要特別注意澄清度，澄清度是影響后續(xù)層析填料及超濾（UF)膜組件使用壽命的關鍵因素之一），澄清度可以通過測濁度的方式檢測；

8.核酸酶處理：澄清后加入核酸酶處理，降解核酸降低粘度，考慮核酸酶活加入的量及酶處理時間，核酸酶處理時要緩慢攪拌，保證處理的均勻性；

9.置換緩沖液：用超濾膜組件進行緩沖液置換，保證緩沖體系適合下一步層析過程，同時置換時也可以適當濃縮，注意超濾時的跨膜壓及超濾時剪切力對病毒完整性的影響；若8工序后的樣品不影響粗純的層析過程（需要從細胞重懸工序開始合理選擇緩沖液，及破碎方式的選擇考慮）此工序可省去；

10.粗純：腺病毒可用陰離子交換層析吸附——洗脫模式(大多數(shù)病毒在中性pH環(huán)境中都帶負電荷）進行粗純及濃縮，推薦使用蘇州藍曉生物科技高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質（Seplife large scale Q )，離子交換層析的過程，病毒被吸附在填料上，吸附的過程也會把病毒濃縮在填料上，蘇州藍曉生物科技的Seplife large scale Q 介質吸附腺病毒的載量在3-6mg/ml(與工藝緩沖液，層析時保留時間，不同腺病毒有關），用陰離子交換層析吸附——洗脫模式粗純腺病毒載體新冠疫苗時，可以運用DOE，系統(tǒng)的表征各個層析工藝參數(shù)，達到最優(yōu)的純化結果（回收率和純度），減輕后續(xù)精純工序的壓力；

11.精純：粗純得到樣本，在通過凝膠過濾層析進一步精細純化，腺病毒分子尺寸比較大（如Ad5分子尺寸約60-70nm，不同型的腺病毒有差異），蘇州藍曉生物科技的Seplife 4FF瓊脂糖微球凝膠過濾介質的平均孔徑在50nm，用此填料腺病毒新冠疫苗被排阻在填料孔道外部，通過填料顆粒間隙流穿，而其它雜質如HCP,HCD,核酸酶等分子尺寸比較小，進入道填料通過擴散的作用進入道填料孔道內部，然后在通過擴散的作用散出填料孔道，這個過程中同樣的緩沖液作用，擴散過程需要更多的熱力學動力（即需要更多的緩沖液作用），而伴隨緩沖液流動的病毒粒子需要的動力小伴隨緩沖液一起流出，通過整個凝膠過濾柱床反復的分離，病毒顆粒在填料柱床的外水體積（即填料顆粒之間的間隙空間，約占柱床體積的30%），病毒分子最先流出柱床，其它物質后面流出柱床，即可實現(xiàn)腺病毒載體新冠疫苗的精細純化。同時精純過程也可以用蘇州藍曉生物科技的復合模式層析介質Seplife? Suncore 700進行純化，病毒溶液進入柱床中，分子尺寸大的病毒顆粒被排阻在填料惰性層外面流穿而過，分子尺寸小的HCP,HCD，內毒素等物質進入到孔內和填料以靜電力，疏水作用力等結合，可以實現(xiàn)高上樣量尺寸排阻層析過程，配合粗純工藝即可完成腺病毒載體的純化。

12.除菌及制劑：略

圖4：腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案（自制）

★★★★★特別注意：每一個單元操作之后進行下一個單元操作時，都必須考慮緩沖液體系的適用性及病毒粒子濃度，是否需要通過超濾濃縮伴隨置換緩沖液的方式調整病毒粒子的濃度和緩沖液體系。

腺病毒載體新冠疫苗下游純化工藝方案一

澄清的病毒溶液經(jīng)高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質Seplife large scale Q 粗純及濃縮，去除大部分的雜質，減少體積，然后在經(jīng)多模式復合型層析介質Seplife? Suncore 700精細純化，即可達到疫苗要求的純度進行后續(xù)的制劑化。

圖5：腺病毒載體新冠疫苗下游純化工藝方案一（自制）

注意事項：

離子交換層析過程需要全面考慮，如上樣量，保留時間，緩沖液種類及濃度及pH，洗脫液種類及pH，濃度，洗脫模式（如高pH低濃度鹽結合高鹽洗脫，高pH低鹽結合低pH低鹽洗脫，低pH中等濃度鹽結合低pH高鹽洗脫等），洗脫過程pH梯度或者鹽梯度或者pH和鹽同時梯度等方式的實施以實現(xiàn)最優(yōu)的分辨率和回收率。離子交換層析是優(yōu)化空間很大的一種層析過程，借助DOE，系統(tǒng)的表征各個層析參數(shù)必要且重要。

同時Seplife large scale Q(平均粒徑90um）也可以用分辨率更高的Seplife large scale Q HP(平均粒徑37um)代替，但高分辨的填料粒徑小，同樣流速下有更高的背壓，所以還要根據(jù)實際情況合理選擇。

腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案二

澄清的病毒溶液經(jīng)高剛性離子交換層析（Seplife large scale Q)粗純及濃縮后，還有微量的雜質需要去除，即可以選擇多模式復合型層析填料（Seplife? Suncore 700）進一步純化也可選擇凝膠過濾層析(Seplife 4FF)進行精細純化。